魏志陽(yáng)，任 雪，韓 經(jīng)，張華東，郭學(xué)武，肖冬光

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

白酒的主要風(fēng)味成分可分為酸類(lèi)、酯類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)及其他五大類(lèi)，其中酯類(lèi)物質(zhì)所占比例最大，而“四大酯”（乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯）約占白酒中總酯含量的90%以上[1]。其中，乳酸乙酯香弱、稍甜，含量較高時(shí)帶澀味，是白酒的重要呈香物質(zhì)[2]，其含量高低直接影響酒的品質(zhì)與風(fēng)格特點(diǎn)[3]。通常認(rèn)為，白酒中乳酸乙酯是由乳酸菌等產(chǎn)酸微生物代謝產(chǎn)生的乳酸與酒精在酯化酶的作用下形成[4]，且以胞外酶的酯化合成為主，但也不排除胞內(nèi)酶的補(bǔ)償作用，如霉菌、某些酵母菌和細(xì)菌分泌的胞外酯化酶等[5-7]。

傳統(tǒng)固態(tài)法的白酒釀造過(guò)程中，其開(kāi)放式的發(fā)酵可使空氣、生產(chǎn)車(chē)間、工具、發(fā)酵設(shè)備等環(huán)境中的微生物通過(guò)大量繁殖而進(jìn)入酒醅內(nèi)，其中以乳酸菌為主，進(jìn)而為乳酸乙酯的合成提供大量前體物[8-9]。近年來(lái)，隨著白酒機(jī)械化和清潔生產(chǎn)的推廣，釀酒環(huán)境衛(wèi)生、勞動(dòng)生產(chǎn)環(huán)境的改善[10]，使得釀酒環(huán)境中乳酸菌的種類(lèi)和數(shù)量減少，尤其在冬季干燥的氣候條件下，易造成發(fā)酵體系中乳酸菌的數(shù)量不足，致使成品酒中乳酸和乳酸乙酯含量下降，使得酒體香味失衡。因而迫切需要開(kāi)發(fā)富含乳酸乙酯的調(diào)味酒用于基酒的勾調(diào)，以彌補(bǔ)基酒乳酸乙酯的不足，保證酒體風(fēng)味協(xié)調(diào)，提高基酒的質(zhì)量。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于生物酯化液的研究較多的是利用黃水等發(fā)酵副產(chǎn)物在酯化酶作用下催化生成己酸乙酯[11-14]，并將其運(yùn)用于濃香型白酒的增香與調(diào)味酒的生產(chǎn)[15]。而對(duì)于酯化生成乳酸乙酯的酯化技術(shù)研究較少[16-17]，關(guān)于利用酯化酶在水相中催化合成乳酸乙酯酯化液并應(yīng)用于白酒勾調(diào)的相關(guān)研究更是鮮有報(bào)道[18]。有文獻(xiàn)報(bào)道[19]，南極假絲酵母（Candida antarctic）脂肪酶B更適合在以非極性溶劑為催化介質(zhì)的反應(yīng)體系中催化酯化反應(yīng)。因此，本研究利用自老白干酒醅中分離獲得的一株高產(chǎn)乳酸干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）發(fā)酵制得乳酸發(fā)酵液，通過(guò)南極假絲酵母（Candida antarctic）脂肪酶B催化乳酸發(fā)酵液與酒尾合成乳酸乙酯，并通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)其催化工藝進(jìn)行優(yōu)化，最后生產(chǎn)用于基酒勾調(diào)的乳酸乙酯調(diào)味酒，旨在彌補(bǔ)冬季生產(chǎn)時(shí)基酒中乳酸乙酯含量不足的問(wèn)題，同時(shí)最大限度利用酒尾中的有益成分，提高資源綜合利用率，實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）：自老白干酒醅中分離獲得，并保藏于本研究室。

1.1.2 試劑

酒尾：老白干酒廠；大米、麥根：市售；南極假絲酵母脂肪酶B（作用pH值2.5～8.0，作用溫度15～55 ℃）：諾維信（中國(guó)）生物科技公司；葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏（均為生化試劑）：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基[20]：葡萄糖20.0 g、蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、檸檬酸二胺2.0 g、K2HPO42.0 g、乙酸鈉8.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、Tween-80 1.0 mL，蒸餾水1 000 mL，自然pH，115 ℃高壓滅菌20 min。

乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基[20]：大米粉30.0 g，麥根粉3.0 g，蒸餾水175 mL，加液化酶5 U/g大米粉，90 ℃液化30 min，加熱煮沸0.5 h，待溫度降至60 ℃，添加糖化酶150 U/g大米粉，于60 ℃水浴鍋中恒溫糖化4 h，降溫至40 ℃時(shí)，添加活化好的酸性蛋白酶5 U/g大米粉，過(guò)濾，調(diào)節(jié)糖度為16°Bx，自然pH，115 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Sever Easy型pH計(jì)：瑞士梅特勒托利多儀器有限公司；Agilent1260-紫外高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)安捷倫科技公司；FA2204B電子天平：上海精密儀器有限公司；DHP恒溫培養(yǎng)箱：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸發(fā)酵液制備

干酪乳桿菌的活化：取一環(huán)保藏于斜面上的干酪乳桿菌接種于裝有10 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管中，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h。

種子液的制備：將活化好的干酪乳桿菌培養(yǎng)液按10%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接于裝有100 mL MRS液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h。

將干酪乳桿菌種子液按10%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接于裝有100 mL乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，添加3.5%無(wú)菌碳酸鈣，密封，于35 ℃條件下靜置發(fā)酵15 d，乳酸含量達(dá)到80 g/L左右，待用。

1.3.2 乳酸乙酯酯化液制備

將酒精度為40%vol的酒尾與乳酸發(fā)酵液按體積比1∶1混勻（總體系100 mL），用1.0 mol/L NaOH及1.0 mol/L H2SO4溶液調(diào)節(jié)混合液的pH值為3.5，添加南極假絲酵母脂肪酶B 0.5 g，于30 ℃條件下靜置反應(yīng)14 d后測(cè)定乳酸乙酯含量。

1.3.3 脂肪酶催化合成乳酸乙酯條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

依據(jù)脂肪酶的催化反應(yīng)特性[21-22]，采用單因素輪換法依次考察pH值（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）、反應(yīng)溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃）、酶用量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）、反應(yīng)時(shí)間（7 d、10 d、14 d、18 d、21 d、25 d、30 d）及酒尾與乳酸發(fā)酵液體積比（1.0∶4.0、1.0∶2.5、1.0∶1.5、1.0∶1.0、1.5∶1.0、2.5∶1.0）對(duì)脂肪酶催化合成乳酸乙酯的影響。

1.3.4 脂肪酶催化合成乳酸乙酯條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，考慮到混合液的自然pH值在3.0左右，且酯化液主要用于白酒調(diào)味酒的生產(chǎn)，確定正交試驗(yàn)pH值為3.0。選取反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、酶用量（C）、酒尾與乳酸發(fā)酵液體積比（D）為考察因素，乳酸乙酯含量（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定該脂肪酶催化合成乳酸乙酯最佳條件組合。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 脂肪酶B催化合成乳酸乙酯條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for optimization of ethyl lactate synthesis conditions catalyzed by lipase B

1.3.5 高乳酸乙酯調(diào)味酒的制備

準(zhǔn)確量取5份相同的高乳酸乙酯酯化液于蒸餾裝置中分別蒸餾、濃縮，接取酒精度分別為35%vol、40%vol、45%vol、50%vol、60%vol的餾出液，通過(guò)比較不同酒精度下餾出液的乳酸乙酯含量及色澤和外觀，確定最適的調(diào)味酒酒精度。

1.3.6 分析方法

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶催化合成乳酸乙酯條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 pH值對(duì)乳酸乙酯合成的影響

pH值對(duì)乳酸乙酯合成的影響見(jiàn)圖1。

圖1 pH值對(duì)乳酸乙酯合成的影響Fig.1 Effect of pH on synthesis of ethyl lactate

由圖1可知，隨著反應(yīng)液pH的增加，乳酸乙酯含量呈先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)反應(yīng)液pH值為3.0時(shí)，乳酸乙酯含量達(dá)到最大值，為9.47 g/L；當(dāng)pH值＜3.0之前，乳酸乙酯含量相對(duì)較高，說(shuō)明酸性環(huán)境較有利于乳酸乙酯的合成；而當(dāng)pH＞3.0之后，隨著pH值的增加，乳酸乙酯含量急劇下降，分析原因可能是由于隨著pH值的升高，酯化酶的催化活性逐漸降低。因此，確定催化體系的最佳pH值為3.0。

2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)乳酸乙酯合成的影響

反應(yīng)溫度對(duì)乳酸乙酯合成的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)乳酸乙酯合成的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on synthesis of ethyl lactate

由圖2可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，乳酸乙酯含量呈先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)反應(yīng)溫度為30 ℃時(shí)，乳酸乙酯含量達(dá)到最大值，為9.64 g/L。分析原因可能是由于在一定溫度范圍內(nèi)，酶活力隨反應(yīng)溫度的增加而逐漸升高；當(dāng)達(dá)到酶的最適溫度時(shí)，酶的活性達(dá)到最大，催化效率最高；當(dāng)超過(guò)酶的最適溫度時(shí)，酶活性則開(kāi)始下降。因此，確定最適反應(yīng)溫度為30 ℃。

2.1.3 酶用量對(duì)乳酸乙酯合成的影響

要抓住黨員領(lǐng)導(dǎo)干部這個(gè)“關(guān)鍵少數(shù)”，把憲法法律教育納入黨員干部學(xué)習(xí)教育體系。各級(jí)人大、政府、監(jiān)委、法院、檢察院等國(guó)家機(jī)關(guān)更要把學(xué)習(xí)憲法作為履行職責(zé)的基本功和必修課，真正使黨員干部特別是領(lǐng)導(dǎo)干部牢固樹(shù)立憲法法律至上、法律面前人人平等的法治理念，不斷提高運(yùn)用法治思維和法治方式解決問(wèn)題的能力和水平，切實(shí)做到依法用權(quán)、秉公用權(quán)。各級(jí)黨員領(lǐng)導(dǎo)干部要自覺(jué)先學(xué)一步、學(xué)深一層，熟知憲法文本，提高憲法意識(shí)，筑牢法治信仰，切實(shí)發(fā)揮好示范引領(lǐng)作用。

酶用量對(duì)乳酸乙酯合成的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 酶用量對(duì)乳酸乙酯合成的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on synthesis of ethyl lactate

由圖3可知，隨著酶添加量的增加，乳酸乙酯含量呈先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)酶添加量為0.4%時(shí)，乳酸乙酯含量達(dá)到最大值，為9.76 g/L；當(dāng)酶添加量＞0.4%之后，乳酸乙酯含量下降。分析原因可能是在一定的酶濃度范圍內(nèi)，酶濃度越大，酶與反應(yīng)底物的接觸幾率越大，酶的催化反應(yīng)效果越好，但當(dāng)酶濃度相對(duì)于底物濃度接近飽和時(shí)，酶濃度對(duì)催化效果影響較小。因此，確定最佳的脂肪酶添加量為0.4%。

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)乳酸乙酯合成的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)乳酸乙酯合成的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)乳酸乙酯合成的影響Fig.4 Effect of reaction time on synthesis of ethyl lactate

由圖4可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸乙酯的含量呈先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)反應(yīng)21 d時(shí)，乳酸乙酯含量達(dá)到最大值，為10.08 g/L；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間＞21 d之后，乳酸乙酯含量下降，說(shuō)明在第21天時(shí)底物的轉(zhuǎn)化合成率達(dá)到最高，而繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間，脂肪酶則主要表現(xiàn)出水解作用，使反應(yīng)向著水解乳酸乙酯的方向進(jìn)行。因此，確定該體系下合成乳酸乙酯的最佳反應(yīng)時(shí)間為21 d。

2.1.5 酒尾與乳酸發(fā)酵液體積比對(duì)乳酸乙酯合成的影響

酒尾與乳酸發(fā)酵液體積比對(duì)乳酸乙酯合成的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 酒尾與乳酸發(fā)酵液體積比對(duì)乳酸乙酯合成的影響Fig.5 Effect of tailing liquor to lactic acid fermentation broth ratio on synthesis of ethyl lactate

由圖5可知，隨著酒尾與乳酸發(fā)酵液體積比的增加，即乙醇含量逐漸提高，乳酸含量逐漸降低，乳酸乙酯含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)酒尾與乳酸發(fā)酵液體積比為1.0∶1.0時(shí)，乳酸乙酯含量達(dá)到最大值，為10.59 g/L。分析原因可能是：酯化反應(yīng)作為一種可逆反應(yīng)，在一定范圍內(nèi)底物乳酸與乙醇含量的增加會(huì)促進(jìn)酯化反應(yīng)向合成乳酸乙酯的正方向進(jìn)行，而當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)低時(shí)酯化酶則會(huì)催化反應(yīng)向水解酯的逆方向進(jìn)行；反應(yīng)底物濃度太高會(huì)抑制脂肪酶的催化活性，甚至失去酶活性。因此，確定該體系下酒尾與乳酸發(fā)酵液的最佳體積比為1.0∶1.0。

2.2 脂肪酶催化合成乳酸乙酯條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乳酸乙酯含量（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、酶用量（C）、酒尾與乳酸發(fā)酵液體積比（D）4個(gè)因素進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

由表2極差分析可知，各因素對(duì)結(jié)果影響的主次順序?yàn)镈＞A＞B＞C，即酒尾與乳酸發(fā)酵液體積比＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間＞酶添加量；該酯化酶催化合成乳酸乙酯的最佳條件組合為A2B2C3D2，即反應(yīng)溫度30 ℃，反應(yīng)時(shí)間21 d，酯化酶添加量0.5%，酒精度40%vol的酒尾與乳酸發(fā)酵液體積比1.0∶1.0。由表3方差分析結(jié)果可知，反應(yīng)溫度和酒尾與乳酸發(fā)酵液體積比對(duì)乳酸乙酯催化合成有顯著影響（P＜0.05），而其他因素對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

表2 脂肪酶B催化合成乳酸乙酯條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for optimization of ethyl lactate synthesis condition catalyzed by lipase B

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

2.2.2 最優(yōu)組合驗(yàn)證

按照上述正交試驗(yàn)得到的乳酸乙酯最佳合成條件組合進(jìn)行了5次平行驗(yàn)證性試驗(yàn)，乳酸乙酯含量為（12.05±0.06）g/L。高于正交試驗(yàn)中的任何一組；且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.51%，說(shuō)明該乳酸乙酯酯化液合成制備工藝穩(wěn)定、可行。

2.3 高乳酸乙酯調(diào)味酒的制備

不同酒精度下餾出液的乳酸乙酯含量及色澤見(jiàn)表4。

表4 調(diào)味酒酒精度對(duì)乳酸乙酯含量和酒體色澤的影響Table 4 Effect of alcohol content of flavoring liquor on ethyl lactate content and liquor body color

由表4可知，隨著調(diào)味酒酒精度的降低，乳酸乙酯的含量逐漸升高，當(dāng)酒精度＜45%vol之前，酒體逐漸出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象。分析原因可能是由于酒尾中含有大量沸點(diǎn)較高的酯類(lèi)、酸類(lèi)，這些物質(zhì)難溶于水，易溶于乙醇。因而最終確定最適調(diào)味酒酒精度為45%vol，此時(shí)酒體無(wú)色透明、無(wú)懸浮物、無(wú)沉淀，乳酸乙酯香味突出，乳酸乙酯含量達(dá)17.62 g/L，可用于乳酸乙酯含量偏低基酒的勾兌與調(diào)味。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)確定南極假絲酵母脂肪酶B催化酒尾和干酪乳桿菌乳酸發(fā)酵液合成乳酸乙酯的最佳催化合成工藝為酒精度40%vol的酒尾與乳酸發(fā)酵液體積比1.0∶1.0，pH值3.0，脂肪酶添加量0.5%，反應(yīng)溫度30 ℃，反應(yīng)時(shí)間21 d。在此最優(yōu)催化合成條件下，酯化液中乳酸乙酯含量達(dá)12.05 g/L。酯化液經(jīng)蒸餾、濃縮后，以酒精度為45%vol的餾出液作為調(diào)味酒，此時(shí)調(diào)味酒中乳酸乙酯含量最高，為17.62 g/L，酒體清澈透明，酯香突出，適用于勾調(diào)冬季或機(jī)械化生產(chǎn)中乳酸乙酯含量偏低的基酒，增加乳酯含量，穩(wěn)定和改善固液結(jié)合白酒或液態(tài)發(fā)酵白酒的質(zhì)量，提高經(jīng)濟(jì)效益。