高亞楠，辛 瑜，張 玲，楊海麟，王 武

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

肌酸酶（creatinase；EC 3.5.3.3；CRE；分類名為肌酸瞇基水解酶，creatinase amidinohydrolase）屬于水解酶類，催化肌酸水解產(chǎn)生尿素和肌氨酸，是肌酐代謝中的關(guān)鍵酶。目前在多種細(xì)菌中均發(fā)現(xiàn)肌酸酶的存在，除了極少數(shù)來(lái)源的肌酸酶以單亞基的形式存在[1-2]，大多數(shù)肌酸酶都是同源二聚體，即由兩個(gè)相同的亞基組成[3-6]，其中對(duì)Pseudomonas putida來(lái)源的肌酸酶研究最多[3，7-12]，Yoshimoto等[3]人從Pseudomonas putida中純化出肌酸酶，并首次獲得酶結(jié)晶，該酶的特性研究表明，酶的相對(duì)分子質(zhì)量為94 000，由2個(gè)相同的亞基組成，亞基相對(duì)分子質(zhì)量為47 000。

血清和尿液中肌酐含量是診斷腎臟功能的重要指標(biāo)，肌酸酶是酶法檢測(cè)肌酐含量的關(guān)鍵酶[13]。但是由于肌酸酶的穩(wěn)定性較差，造成酶活性損失嚴(yán)重，限制了其工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。已有通過(guò)添加穩(wěn)定劑、分子改造和固定化等方法提高肌酸酶穩(wěn)定性的報(bào)道，Schumann等[10]研究了惡臭假單胞菌肌酸酶的穩(wěn)定劑，發(fā)現(xiàn)在酶溶液中添加DTE、BSA或甘油能改善酶的穩(wěn)定性，而進(jìn)一步用隨機(jī)突變的方法對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，得到了A109V、V355M、V182I、A109V+V355M 和 A109V+V355M+V182I 等5種突變體，穩(wěn)定性均有所提高[11]；Berberich等[12]用聚氨酯固定化修飾放線桿菌來(lái)源的肌酸酶，提高了酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

作者嘗試通過(guò)化學(xué)修飾法改善雙亞基肌酸酶的穩(wěn)定性。多亞基酶失活的第一步通常是亞基解離，因此保護(hù)多亞基酶的首要目標(biāo)是防止多亞基酶的解聚[14]。多聚賴氨酸是含有多個(gè)游離氨基的多聚物長(zhǎng)鏈，可以與酶分子表面羧基相互作用形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，環(huán)繞覆蓋在酶表面，起到分子捆綁的作用，使酶的空間結(jié)構(gòu)更加緊密，從而提高酶的穩(wěn)定性。作者選取Pseudomonas putida來(lái)源的具有兩個(gè)相同亞基的肌酸酶為研究對(duì)象，考察多聚賴氨酸對(duì)酶的修飾效果，該法對(duì)雙亞基肌酸酶熱穩(wěn)定性提高具有一定的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

3 500～4 500 的多聚賴氨酸（poly-lysine）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC）：均購(gòu)自Sigma；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或色譜純?cè)噭Ｖ亟ME.coliBL21（DE3）/pET28a-CRE：由作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 肌酸酶基因的表達(dá)與酶的純化

重組E.coliBL21（DE3）/pET28a-CRE 在 LB 培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，種子液以體積分?jǐn)?shù)5%轉(zhuǎn)接于新的LB培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD達(dá)到0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，并把溫度降至16℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h。8 000 r/min離心5 min收集菌體后，用pH 7.5、50 mmol/L的磷酸緩沖液重懸菌體，冰水浴超聲破碎菌體，破壁后8 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。采用載體上的組氨酸標(biāo)簽，將粗酶液用鎳柱進(jìn)行親和層析，獲得純酶液。

1.3 肌酸酶分子表面氨基酸分析

從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)查找Pseudomonas putida來(lái)源的肌酸酶的結(jié)構(gòu)（PDB ID：1CHM），然后用Pymol軟件對(duì)肌酸酶表面的酸堿性氨基酸的數(shù)目進(jìn)行分析。

1.4 肌酸酶修飾正交試驗(yàn)

以肌酸酶表面羧基與poly-lysine氨基摩爾比（A）、CRE-COOH 與 EDC的摩爾比 （B）、 反應(yīng) pH（C）為考察因素。4℃緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)混勻過(guò)夜，計(jì)算相對(duì)酶活力；將不同的摩爾比例獲得的修飾酶超濾除去未結(jié)合的小分子修飾劑，置于37℃恒溫水浴中，48 h后測(cè)定其酶活力，并計(jì)算其酶活力保留率。以相對(duì)酶活力與酶活保留率作為試驗(yàn)指標(biāo)，利用正交表L9（34）設(shè)定三因素三水平正交試驗(yàn)，見表1。

表1 正交因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.5 肌酸酶的活性測(cè)定

單位酶活定義：1 min內(nèi)將肌酸水解產(chǎn)生1 μmol尿素所需要的酶量[15]。

試劑配制：0.1 mol/L肌酸溶液 （以50 mmol/L磷酸緩沖液，新鮮配制）；對(duì)-二甲氨基苯甲醛溶液（溶2 g對(duì)-二甲氨基苯甲醛于100 mL二甲基亞砜中，然后加濃鹽酸15 mL）。

測(cè)定方法：在試管中加入0.9 mL肌酸溶液，室溫平衡5 min后加入0.1 mL待測(cè)酶液，在37℃反應(yīng)10 min，然后向反應(yīng)體系中加入2 mL對(duì)-二甲氨基苯甲醛溶液終止反應(yīng)，并置于25℃溫育20 min，在435 nm處測(cè)定吸光度值[16]。

1.6 SDS-PAGE凝膠電泳分析

用最優(yōu)方案對(duì)肌酸酶進(jìn)行肌酸酶的poly-lysine修飾，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對(duì)游離酶與修飾酶進(jìn)行分析，推測(cè)poly-lysine對(duì)肌酸酶的修飾程度。

1.7 差示掃描量熱分析（DSC）

利用TA的Nano DSC差示掃面量熱儀研究游離肌酸酶及修飾酶的熱穩(wěn)定性。取一定量的游離酶和修飾酶，使用磷酸緩沖液為基線，溫度掃描范圍為20～90℃，升溫速率為1℃/min。

1.8 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

用pH 7.5的50 mmol/L磷酸緩沖液配制濃度分別為10～100 mmol/L的肌酸溶液，于37℃反應(yīng)10 min，測(cè)定游離酶和修飾酶在不同肌酸濃度時(shí)初始活力，得到反應(yīng)速度V。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，以1/[S]為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)作圖，分別計(jì)算酶游離酶與修飾酶的Km與kcat值。

1.9 穩(wěn)定性分析

將游離酶溶液和修飾酶置于50 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.5）中，在不同的溫度（25、30、35、40、45和 50℃）下放置30 min，測(cè)定游離酶和修飾酶酶活力，以酶活力最高值為100%計(jì)算相對(duì)活性，確定酶的熱穩(wěn)定性。

將游離酶溶液和固定化酶置于不同pH值的緩沖溶液（pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和 10.0）中，25℃放置16 h，測(cè)定游離酶和修飾酶酶活力，以酶活力最高值為100%計(jì)算相對(duì)活性，確定酶的pH穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 肌酸酶分子表面酸性氨基酸分析

多聚賴氨酸的共價(jià)修飾取決于酶表面的酸性氨基酸的個(gè)數(shù)，根據(jù)肌酸酶的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)（PDB ID：1CHM） 分析，Pseudomonas putida來(lái)源肌酸酶含有108個(gè)酸性氨基酸，其中76個(gè)酸性氨基酸位于酶分子的表面，且側(cè)鏈官能團(tuán)暴露于酶表面，可以參與酶分子表面poly-lysine的修飾。

圖1 肌酸酶結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Structure analysis of creatinase

多聚賴氨酸修飾肌酸酶酶分子的途徑見圖2。首先采用EDC活化肌酸酶分子表面羧基生成EDC-羧酸中間體，該中間體與poly-lysine中游離的氨基相互作用形成共價(jià)鍵[17]。poly-lysine在肌酸酶表面形成共價(jià)修飾，以增強(qiáng)肌酸酶的穩(wěn)定性。

圖2 poly-lysine表面修飾肌酸酶示意圖Fig.2 Modification of creatinase with poly-lysine

由于交聯(lián)類型不同，EDC活化肌酸酶后可以產(chǎn)生不同的交聯(lián)結(jié)構(gòu)。poly-lysine分別在單個(gè)亞基上形成共價(jià)修飾；poly-lysine覆蓋跨越兩個(gè)亞基，使兩個(gè)亞基緊密結(jié)合在一起；酶分子間交聯(lián)。EDC是一種異型雙功能試劑，可能引起酶分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)，也會(huì)引起poly-lysine分子間的交聯(lián)[18]。

2.2 多聚賴氨酸修飾肌酸酶的條件優(yōu)化

化學(xué)修飾反應(yīng)過(guò)程中，酶與修飾劑的比例、活化反應(yīng)、修飾反應(yīng)的pH等均會(huì)影響修飾程度和修飾酶的性質(zhì)。正交試驗(yàn)中有兩個(gè)考察指標(biāo)，它們是修飾酶的相對(duì)酶活力和修飾酶在37℃放置48 h后的酶活力保留率。根據(jù)綜合平衡法，先分別考察每個(gè)因素對(duì)各指標(biāo)的影響，然后進(jìn)行分析比較，確定出最好的水平。

修飾劑用量會(huì)影響酶的修飾率和修飾酶的性質(zhì)。修飾劑用量越大，酶分子的修飾程度也越高。另一方面，酶表面偶聯(lián)的大分子修飾劑會(huì)產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，使底物不易與酶活性中心相互作用而使酶活性下降[19]。從表2可知，對(duì)兩個(gè)指標(biāo)來(lái)說(shuō)，修飾劑用量是較次要的因素，對(duì)相對(duì)酶活力來(lái)講，取A2水平為最好，A3水平也不差，對(duì)酶活力保留率來(lái)講，取A3水平為最好，綜合考慮修飾劑用量取A3為最好，即CRE-COOH與poly-lysine-NH2的摩爾比為1∶100。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

EDC可以與肌酸酶分子表面的羧基反應(yīng)生成具有氨基反應(yīng)活性的中間體，該中間體可以迅速與多聚賴氨酸中的游離氨基反應(yīng)形成穩(wěn)定的交聯(lián)產(chǎn)物，但該中間體在水溶液中是不穩(wěn)定的，若不能及時(shí)與氨基反應(yīng)，則會(huì)分解為原來(lái)的羧基[20]。對(duì)于酶表面羧基與EDC摩爾比，從相對(duì)酶活力來(lái)看，其影響力最小，取B1水平為最好，推測(cè)是由于高濃度的EDC會(huì)造成其在肌酸酶分子內(nèi)部堆積，抑制酶活性位點(diǎn)與底物的結(jié)合，造成酶活力下降。從酶活力保留率來(lái)看，其極差最大，表明其對(duì)修飾酶的性質(zhì)影響最大，取B3水平為最好。綜合EDC用量取B3水平為最好，即CRE-COOH與EDC的摩爾比為1∶10。

pH決定了酶蛋白中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)，設(shè)置不同的pH值，可以控制基團(tuán)的解離程度，從而有利于修飾的專一性。pH值過(guò)低會(huì)造成酶活性損失，若pH值過(guò)高，在酶分子修飾過(guò)程中，不利于EDC活化肌酸酶表面的羧基，并且形成的中間體易發(fā)生水解反應(yīng)[21]。對(duì)兩個(gè)指標(biāo)綜合考慮，pH值取C2為最好，即最適反應(yīng)pH為7.0。

綜合分析優(yōu)化條件，CRE-COOH：poly-lysine-NH2取 1∶100，CRE-COOH：EDC 取 1∶10，pH 為 7.0。

2.3 修飾酶的SDS-PAGE鑒定

用十二烷基硫酸鈉（SDS）將蛋白質(zhì)變性，在變性條件下，生物分子以變性的單體或亞基多肽-SDS復(fù)合體存在，單體或亞基多肽的分子質(zhì)量差異造成了不同的遷移率。

如圖3，游離肌酸酶在SDS-PAGE中表現(xiàn)出單一條帶，單亞基相對(duì)分子質(zhì)量為47 000，而修飾酶泳道出現(xiàn)多條帶，相對(duì)分子質(zhì)量最小的條帶似乎略高于游離酶單亞基的位置，而高位條帶的相對(duì)分子質(zhì)量甚至出現(xiàn)倍乘的現(xiàn)象。說(shuō)明肌酸酶表面的羧基不同程度的與poly-lysine共價(jià)結(jié)合，形成穩(wěn)定的交聯(lián)產(chǎn)物。

圖3 肌酸酶修飾的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of creatinase modified

2.4 修飾酶與游離酶酶學(xué)性質(zhì)的比較

經(jīng)修飾后酶的比酶活、Km、kcat與kcat/Km均減小。Km值的減小可能是由于底物肌氨酸與兩性離子型聚合物（poly-lysine）之間的相互作用，在底物結(jié)合區(qū)域維持較高的局部底物濃度，使得修飾酶與底物肌酸之間的親和力得到加強(qiáng)；但也可能會(huì)造成酶分子柔性的降低及底物擴(kuò)散阻力增加，使得修飾酶kcat減小。修飾后的kcat/Km值減小，說(shuō)明修飾后催化效率有所下降，導(dǎo)致比酶活降低，見表3。

表3 修飾酶與游離酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較Table 3 Kinetic parameters parameters of the free and modified creatinase

2.5 修飾酶與游離酶的穩(wěn)定性比較

差式掃描量熱法（DSC）一種熱分析方法，可以測(cè)定蛋白質(zhì)分子的半解折疊溫度（Tm），分析其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，以推測(cè)肌酸酶修飾后穩(wěn)定性是否增加。結(jié)果表明，游離酶和修飾酶的熱變性溫度Tm分別為48.84℃和50.91℃，相同的升溫速率，修飾酶比游離酶的Tm值高了2.07℃。

肌酸酶經(jīng)poly-lysine修飾前后熱穩(wěn)定性的變化見圖4（a）。游離酶在35～45℃的環(huán)境下酶活隨著溫度的升高而迅速降低，在40℃時(shí)酶活已下降為30%以下，而修飾酶在40℃處理30 min，酶活保留率仍在50%以上。肌酸酶經(jīng)修飾后熱穩(wěn)定性明顯提高。修飾后pH穩(wěn)定性也有了明顯的提高，見圖4（b）。在pH值為4.0和10.0時(shí)，修飾酶酶活力仍保留在50%以上，而游離酶幾乎沒(méi)有活性。

圖4 游離酶與修飾酶的熱穩(wěn)定性與pH穩(wěn)定性分析Fig.4 Thermal and pH stabilities of free and modified enzyme

推測(cè)poly-lysine修飾后，在肌酸酶酶表面形成“分子捆綁”作用，在一定程度上增強(qiáng)亞基間相互作用，多聚賴氨酸在單亞基表面形成覆蓋層，也可使得單亞基構(gòu)象次級(jí)鏈得到保護(hù)，從而抵御不良環(huán)境對(duì)酶的破壞，提高酶的穩(wěn)定性。

3 結(jié) 語(yǔ)

Pseudomonas putida肌酸酶為含兩個(gè)相同亞基的同源二聚體，采用相對(duì)分子質(zhì)量4 000左右的poly-lysine對(duì)肌酸酶進(jìn)行表面修飾，發(fā)現(xiàn)修飾酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性均有不同程度的提高。SDSPAGE電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，poly-lysine分子捆綁后還出現(xiàn)了具倍乘關(guān)系的高相對(duì)分子質(zhì)量肌酸酶聚合物的出現(xiàn)，可在進(jìn)一步的研究中對(duì)其他修飾條件進(jìn)行優(yōu)化，例如調(diào)整poly-lysine的長(zhǎng)度，肌酸酶的濃度等。本研究提供了一種新的提高肌酸酶穩(wěn)定性的方法，并且也為其他多亞基酶的穩(wěn)定性改造提供了一條可行的途徑。