王開梅 胡祥英 鄭光強 邱文海 林志雄

[摘要] 目的 研究外周血去整合素金屬蛋白酶8（ADAM8）、干擾素調(diào)控因子1（IRF1）的表達水平與支氣管哮喘（BA）患兒肺功能的相關(guān)性。 方法 選擇2018年1～8月在?？谑袐D女兒童醫(yī)院（以下簡稱“我院”）接受治療的84例BA患兒作為觀察組，根據(jù)病情嚴重程度將其分為輕度組（30例）、中度組（44例）、重度組（10例）。另選同期在我院進行體檢的健康兒童80名作為對照組。檢測并比較各組肺功能指標及外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表達水平，分析觀察組患兒外周血ADAM8、IRF1的蛋白表達與其肺功能指標的相關(guān)性。 結(jié)果 觀察組及輕、中、重度組外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表達水平均明顯高于對照組，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）;重度組和中度組外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表達水平明顯高于輕度組，且重度組高于中度組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。觀察組及輕、中、重度組患兒第1秒用力呼氣容積（FEV1）、FEV1與用力肺活量的比值（FEV1/FVC）及呼氣峰流速（PEF）均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;重度組和中度組FEV1、FEV1/FVC及PEF均明顯低于輕度組，且重度組低于中度組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果示，患兒外周血ADAM8、IRF1的蛋白表達與其FEV1、FEV1/FVC及PEF均呈負相關(guān)（rADAM8=-0.780、-0.773、-0.682，均P < 0.01;rIRF1=-0.684、-0.710、-0.768，均P < 0.01）。 結(jié)論 BA患兒外周血ADAM8和IRF1表達水平明顯升高，且二者與肺功能具有密切關(guān)系，臨床上可考慮將二者納入BA患兒的監(jiān)測靶點，從而輔助診治過程。

[關(guān)鍵詞] 外周血;去整合素金屬蛋白酶8;干擾素調(diào)控因子1;支氣管哮喘;肺功能;相關(guān)性

[中圖分類號] R725.6? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）08（c）-0095-05

[Abstract] Objective To study the correlation of the expression of deintegrin metalloproteinase 8 （ADAM8）， interferon regulatory factor 1 （IRF1） in peripheral blood and pulmonary function in children with bronchial asthma （BA）. Methods Eighty-four children with BA who were treated in Haikou Women & Children Hospital （"our hospital" for short） from January to August 2018 were selected as observation group， and they were divided into mild group （30 cases）， moderate group （44 cases） and severe group （10 cases） according to the severity of the disease. Eighty healthy children who underwent physical examination in our hospital at the same time were selected as control group. The pulmonary function indices， the expression levels of ADAM8， IRF1 mRNA and protein in peripheral blood of each group were detected and compared. The correlation between the expression of ADAM8， IRF1 protein in peripheral blood and pulmonary function indices was analyzed. Results The expression levels of ADAM8， IRF1 mRNA and protein in peripheral blood of observation group and mild， moderate， severe group were significantly higher than those of the control group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）; the expression levels of ADAM8， IRF1 mRNA and protein in peripheral blood of the severe group and moderate group were significantly higher than the mild group， and those of the severe group were significantly higher than the moderate group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The forced expiratory volume in 1 second （FEV1）， FEV1/forced vital capacity （FEV1/FVC）， peak expiratory flow （PEF） in the observation group and mild， moderate， severe group were significantly lower than the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The levels of FEV1， FEV1/FVC and PEF in the severe group and moderate group were significantly lower than the mild group， while the severe group was significantly lower than the moderate group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Pearson correlation analysis showed that， the expression of ADAM8， IRF1 protein was negatively correlated with FEV1， FEV1/FVC and PEF （rADAM8=-0.780， -0.773， -0.682， P < 0.01; rIRF1=-0.684， -0.710， -0.768， P < 0.01）. Conclusion The expression of levels ADAM8 and IRF1 in peripheral blood of children with BA are significantly increased， and it is closely related to pulmonary function. It can be considered as the monitoring target of children with BA， in order to assist the diagnosis and treatment process.

[Key words] Peripheral blood; Deintegrin metalloproteinase 8; Interferon regulatory factor 1; Bronchial asthma; Pulmonary function; Correlation

支氣管哮喘（bronchial asthma，BA）屬于兒童時期的常見病及多發(fā)病，患兒通常會產(chǎn)生急性發(fā)作的癥狀，如出現(xiàn)呼吸道平滑肌的持續(xù)性痙攣，損害正常肺通氣功能，并可引起呼吸功能障礙，常需及時予以藥物干預(yù)[1]。臨床治療BA的藥物主要有糖皮質(zhì)類激素藥物和長效β2激動劑等，雖能產(chǎn)生一定的療效，但在患兒病情較重時則應(yīng)用效果不佳，這就使得尋找新型治療靶點顯得尤為重要[2]。去整合素金屬蛋白酶8（deintegrin metalloproteinase 8，ADAM8）屬于保守性較高的跨膜分泌糖蛋白，其與氣道炎癥細胞在機體內(nèi)的遷移具有一定關(guān)聯(lián)。干擾素調(diào)控因子1（interferon regulatory factor 1，IRF1）屬于轉(zhuǎn)錄因子的一個家庭成員，其可在細胞免疫及分化過程中發(fā)揮作用[3-4]。本研究通過分析外周血ADAM8及IFR1表達與BA患兒肺功能的關(guān)性，旨在為臨床診治BA選擇新型監(jiān)測靶點，并提供數(shù)據(jù)支持，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年1～8月在海口市婦女兒童醫(yī)院（以下簡稱“我院”）接受治療的BA患兒84例作為觀察組。納入標準：①符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[5]中關(guān)于BA的診斷標準;②年齡≤12歲;③患兒家屬對本研究知情并簽署知情同意書。排除標準：①合并呼吸系統(tǒng)其他疾病者;②合并血液系統(tǒng)疾病、感染性或免疫性疾病者;③有創(chuàng)傷或惡性腫瘤者;④入組前4周內(nèi)應(yīng)用過激素及免疫抑制劑等藥物治療者。84例觀察組患兒中，男43例，女41例;年齡4～12歲，平均（7.95±0.45）歲;平均病程（18.36±3.20）個月。根據(jù)《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[5]中病情嚴重程度評分標準將BA患兒分為輕度組（30例）、中度組（44例）、重度組（10例）。另選同期在我院進行體檢的健康兒童80名作為對照組，男45名，女35名;年齡5～12歲，平均（7.97±0.59）歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。本研究已經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核及批準。

1.2 儀器與試劑

瑞士Roche公司生產(chǎn)的TRIzol（貨號：15596026）;瑞士Roche公司生產(chǎn)的蛋白裂解液（批號：161306）;BECKMAN OPTIMA XPN-100超速離心機，離心半徑為10 cm;日本TaKaRa公司生產(chǎn)的Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：638313）;美國伯樂公司生產(chǎn)的Bio-Rad PCR儀（貨號：179203）;賽默飛世爾科技（中國）有限公司生產(chǎn)的SYBR Green Master Mix、BCA試劑盒（貨號：23221）;天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的RNase-free H2O（貨號：RT121-02）、LcDNA（貨號：KR202-01）;購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司的ADAM8酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（貨號：10548）、IRF1 ELISA試劑盒（貨號：10511）。

1.3 標本采集

入組后晨間抽取各組受試者空腹靜脈血6 mL，置入乙二胺四乙酸抗凝管內(nèi)，通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心法將外周血的血清及單個核細胞進行分離，并將血清分裝進200 μL的EP管中，置于-70℃冰箱中保存。單個核細胞添加200 μL TRIzol或200 μL蛋白裂解液后，置于-70℃冰箱中保存。

1.4 熒光定量PCR法測定ADAM8、IRF1的mRNA表達

通過TRIzol法將外周血中單個核細胞的總RNA予以提出，并通過Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA的合成，其中ADAM8的正向引物為5′-GGGAGAAAC-AACGAAGTTG-3′，反向引物為5′-GGTGTGATCAA-GCACAGAT-3′;IRF1的正向引物為5′-GCGGCACCTGGCGCACGGCT-3′，反向引物為5′-GGTGGCAA-GCACCAAGAC-3′;β-actin的正向引物為5′-GTGA-CGTGGACAATCCGCAAG-3′，反向引物為5′-GGAA-GGTGGACAACGGACGC-3′。反應(yīng)體系為10 μL，其中含0.5 μL的100 ng/μL cDNA，5 μL的SYBR Green Master Mix，10 μmol/L的正/反向引物各有0.4 μL，3.7 μL的RNase-free H2O。通過Bio-Rad PCR儀實施擴增。設(shè)置反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，40個循環(huán)。通過2-△△Ct法實施數(shù)據(jù)分析，對每個樣品實施3次重復(fù)。

1.5 Western blot法測定ADAM8及IRF1蛋白表達

提出外周血內(nèi)的單個核細胞有關(guān)總蛋白，通過BCA試劑盒檢測蛋白總量。ADAM8及IRF1單克隆抗體干粉試劑（購自美國的Santan Cruz公司，貨號：159472、163108），鼠源性單克隆抗體肌動蛋白（β-actin）及辣根過氧化物酶所標記的羊抗鼠二抗（購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：257060、203471）。其中一抗的稀釋度為1∶500，二抗的稀釋度為1∶1000。將β-actin蛋白設(shè)置為內(nèi)參，采用Western blot法測定血清ADAM8蛋白水平及單個核細胞內(nèi)IRF1蛋白的表達水平，本次實驗重復(fù)3次，并用Tanon全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)實時圖像采集，對蛋白表達水平實施半定量分析。

1.6 肺功能測定

采用法國迪爾肺功能測定儀檢測各組受試者肺功能，所有指標均一次性同步檢測，每項檢測需重復(fù)至少3次，確保數(shù)值變化<5%，將最佳值用于數(shù)據(jù)分析。主要檢測指標包含：①第1秒用力呼氣容積（FEV1）;②FEV1與用力肺活量的比值（FEV1/FVC）;③呼氣峰流速（PEF）[6]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗;計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗;相關(guān)性分析采用Pearson法進行。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表達水平比較

觀察組的外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表達水平均明顯高于對照組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。觀察組各亞組外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表達水平比較，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。觀察組各亞組ADAM8、IRF1的mRNA相對表達量及蛋白表達水平均高于對照組，且重度組和中度組高于輕度組，重度組高于中度組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1、表1。

2.2 各組肺功能指標的比較

觀察組的FEV1、FEV1/FVC及PEF水平明顯低于對照組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。觀察組各亞組肺功能指標比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。觀察組各亞組的FEV1、FEV1/FVC及PEF水平低于對照組，且重度組和中度組低于輕度組，重度組低于中度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 患兒外周血ADAM8、IRF1的蛋白表達與其肺功能指標的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果示，患兒外周血ADAM8、IRF1的蛋白表達與其FEV1、FEV1/FVC以及PEF均呈負相關(guān)（rADAM8=-0.780、-0.773、-0.682，均P < 0.01;rIRF1=-0.684、-0.710、-0.768，均P < 0.01）。

3 討論

臨床上，BA屬于一類十分常見的呼吸系統(tǒng)疾病，其在兒童群體中的發(fā)病率較高，且近年來的發(fā)病率增高趨勢越來越明顯。BA患兒通常會表現(xiàn)出呼吸困難、胸悶，以及咳嗽、喘息等諸多癥狀，且在過敏原刺激等多種因素的誘導(dǎo)下較易產(chǎn)生急性發(fā)作的現(xiàn)象，對患兒的日常生活造成了較大的危害[7]。目前認為，在BA患兒疾病進展中，炎癥和免疫反應(yīng)產(chǎn)生了重要的作用[8-9]?；純汉粑到y(tǒng)在長期炎癥的影響下，氣道高反應(yīng)明顯加劇，喘息和呼吸困難等癥狀反復(fù)發(fā)作，最終可能致使肺部通氣功能障礙，并導(dǎo)致氣道狹窄，從而進一步增加治療難度。目前，臨床上治療BA的藥物主要是長效β2激動劑以及皮質(zhì)類固醇等，雖然具有一定的療效[10-13]，但對于重度BA的療效并不顯著。因此，尋找新型治療靶點對于重度BA而言十分必要。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，ADAM8和IRF1與機體內(nèi)的炎癥及免疫反應(yīng)聯(lián)系緊密，因此分析二者與BA患兒肺功能之間的關(guān)系，可能有助于更好地診治BA[14-15]。

FEV1、FEV1/FVC及PEF為常用的監(jiān)測肺功能的重要指標，ADAM8和IRF1與免疫炎性反應(yīng)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組的FEV1、FEV1/FVC及PEF水平較對照組明顯降低，提示BA患兒的肺功能明顯下降;而外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表達水平明顯升高，分析原因，肺功能的下降主要與患兒的呼吸系統(tǒng)受損有關(guān)，ADAM8、IRF1的表達上升提示二者均參與到了BA的發(fā)病進程中。ADAM8是分泌性糖蛋白有關(guān)金屬蛋白酶的家族成員，其在嗜酸/中性粒細胞及巨噬細胞，以及單核細胞等免疫細胞中均可表達，并能調(diào)節(jié)炎癥細胞的遷移過程，還可使炎癥細胞自肺部清除，具有一定的抗炎特性[16-18]。然而，ADAM8與氣道內(nèi)的炎癥細胞和嗜中性粒細胞聚集過程也存在一定關(guān)系，可使炎癥細胞逐漸向BA患兒的氣道遷移，而高水平的ADAM8表達則可誘導(dǎo)BA形成，最終促進病情的發(fā)展。IRF屬于轉(zhuǎn)錄因子的一種，其主要定位在細胞核，可經(jīng)干擾素的信號通路（γ-干擾素/Jak/STAT1）有效參與到多種基因的表達過程中，并可參與細胞免疫及細胞分化等病理生理性過程[19-21]。IRF的高表達主要可能通過免疫炎性反應(yīng)對BA患兒的肺功能產(chǎn)生影響，最終加速了病情的進展。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著患兒病情的加重，ADAM8和IRF1的表達水平明顯升高，而肺功能則明顯減弱。進一步發(fā)現(xiàn)，患兒外周血ADAM8和IRF1的蛋白表達與其FEV1和FEV1/FVC，以及PEF均呈負相關(guān)，提示ADAM8、IRF1的表達與BA患兒的病情進展及肺功能受損密切相關(guān)。原因考慮是與ADAM8、IRF1二者通過對B淋巴細胞、單核細胞及樹突狀細胞等有關(guān)免疫細胞和炎性反應(yīng)的共同調(diào)節(jié)作用有關(guān)。這同時也提示臨床上可通過監(jiān)測ADAM8、IRF1在BA患兒外周血中的表達情況以輔助診治，在既往的報道[22-24]中也有類似結(jié)論。需要指出的是，本次研究也存在一定的不足，比如研究樣本比較少、研究涉及面相對較窄，今后可通過邀請同級及上級醫(yī)療機構(gòu)共同開展大樣本容量的綜合研究，從而獲得更具代表性及精準性的研究結(jié)論。

綜上所述，BA患兒外周血ADAM8和IRF1的表達水平明顯升高，且二者與肺功能具有密切的關(guān)聯(lián)，臨床上可考慮將二者納入BA患兒的監(jiān)測靶點，從而輔助診治過程。

[參考文獻]

[1]? 劉敏，易國萍，張良，等.高強度間歇運動鍛煉聯(lián)合藥物治療對哮喘患兒氣道功能、炎性因子分泌的影響[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2018，24（3）：331-334.

[2]? 郭楠，張夢.綜合排痰輔助治療小兒哮喘樣支氣管炎效果觀察及對患兒氣道高反應(yīng)性的預(yù)防分析[J].罕少疾病雜志，2018，25（1）：30-32.

[3]? 李小卉，陳俊松.硫酸鎂聯(lián)合硫酸沙丁胺醇霧化吸入對支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血中性粒細胞彈性蛋白酶水平的影響研究[J].國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報，2018，24（4）：470-472.

[4]? Paulissen G，Rocks N，Gueders MM，et al. ADAM-8，a met-alloproteinase，drives acute allergen-induced airway inflam-mation [J]. Eur J Immunol，2011，41（2）：380-391.

[5]? 中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組，《中華兒科雜志》編輯委員會.兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）[J].中華兒科雜志，2016，54（3）：167-181.

[6]? Knolle MD，Nakajima T，Hergrueter A，et al. Adam8 limits the development of allergic airway inflammation in mice [J]. J Immunol，2013，190（12）：6434-6449.

[7]? 王建榮，呂既壽，多力坤·木扎帕爾，等.ADAM33基因F+1多態(tài)性、IgE、維生素D與烏魯木齊地區(qū)維吾爾族、漢族哮喘兒童的相關(guān)性研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2017， 40（1）：62-65.

[8]? 肖秋林，秦曉敏.沙美特羅替卡松聯(lián)合孟魯司特對咳嗽變異性哮喘患兒肺功能及血清炎性因子的影響[J].中國基層醫(yī)藥，2018，25（2）：182-185.

[9]? Chen J，Jiang X，Duan Y，et al. ADAM8 in asthma. Friend or foe to airway inflammation [J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2013，49（6）：875-884.

[10]? 曹欣，劉章華，任加紅.吸入性沙美特羅替卡松聯(lián)合孟魯司特鈉治療兒童支氣管哮喘的臨床分析[J].醫(yī)學(xué)綜述，2018，24（18）：3728-3732.

[11]? 羅亞輝，廖志雄.長期吸入不同糖皮質(zhì)激素類藥物對支氣管哮喘患兒生長發(fā)育的影響[J].河北醫(yī)學(xué)，2017，23（4）：628-632.

[12]? 陳光熹，楊永紅.支氣管哮喘患者小氣道功能評估及治療的研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2018，24（22）：4507-4511.

[13]? 車向郁.支氣管哮喘兒童血清25-（OH）D3、IgE、IL-17、TGF-β1水平變化及意義[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2017，12（3）：306-308.

[14]? 梁雯慧，莊帝錢，劉雅玲，等.支氣管哮喘患兒外周血中ADAM8，IRF1的表達水平及其臨床意義[J].臨床與病理雜志，2017，37（12）：2583-2588.

[15]? 李茉莉，潘頻華，胡成平，等.干擾素調(diào)節(jié)因子1在呼吸道合胞病毒感染后氣道神經(jīng)源性炎癥的調(diào)控作用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2013，23（18）：21-24.

[16]? 陳福將，蔡振蕩，李銳，等.毛細支氣管炎患兒外周血 ADAM8、CD23 水平及臨床意義[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，24（11）：996-997.

[17]? 葉金漢，陳廣.喘可治聯(lián)合布地奈德治療咳嗽變異性哮喘的效果及對炎癥介質(zhì)、免疫失衡的影響[J].現(xiàn)代醫(yī)院，2018，18（3）：411-413.

[18]? 呂既壽，江麗汗·阿黑哈提，王建榮，等.ADAM33基因V4位點多態(tài)性和維生素D水平與烏魯木齊地區(qū)支氣管哮喘兒童相關(guān)性研究[J].中國兒童保健雜志，2017， 25（3）：248-250.

[19]? 張秋玲，韓超，徐俊，等.翹芩清肺劑對哮喘大鼠氣道平滑肌細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路的影響[J].世界中醫(yī)藥，2018，13（7）：167-171.

[20]? Holgate ST. Innate and adaptive immune responses in asthma [J]. Nat Med，2012，18（5）：673-683.

[21]? 姚麗丹，崔世紅，齊曼古力·吾守爾，等.去整合素金屬蛋白酶33基因多態(tài)性與新疆維吾爾族人群支氣管哮喘及其嚴重程度的關(guān)系[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2014，94（24）：1866-1869.

[22]? Dou L，Liang HF，Geller DA，et al. regulation role of interferon regulatory factor-1 gene and clinical relevance [J]. Hum Immunol，2014，75（11）：1110-1114.

[23]? 張珺.干擾素調(diào)節(jié)因子4與T細胞分化及免疫性疾病的研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2016，22（1）：9-12.

[24]? 李越峰，張睿，王佳，等.宣肺益氣散對支氣管哮喘緩解期肺脾氣虛證患者療效及免疫功能影響[J].臨床軍醫(yī)雜志，2018，46（2）：136-138.

（收稿日期：2018-11-16? 本文編輯：任? ?念）