延胡索總生物堿的急性毒性及其鎮(zhèn)痛作用研究

王群星, 石楠 吳瑾瑾 石森林

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053 2.金華市中心醫(yī)院

延胡索又名元胡、延胡、元胡索，是罌粟科植物延胡索（Corydalis Rhizoma）的干燥塊莖[1-2]，為歷代中醫(yī)藥學(xué)家推崇的鎮(zhèn)痛藥，具有活血化瘀、理氣止痛等功效[3]?！侗静菥V目》記載延胡索“專治一身上下諸痛”[4]，《本草正義》云其“……主一切肝胃胸腹諸痛……”[5]?，F(xiàn)代研究表明，生物堿是延胡索主要活性成分之一，主要包括延胡索甲素、延胡索乙素、脫氫紫堇堿等[6-9]，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗?jié)兊茸饔肹10-12]。中藥的有效成分是發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，目前國內(nèi)外已對(duì)延胡索乙素的鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行了詳盡的研究[13-15]，但有關(guān)延胡索總生物堿的鎮(zhèn)痛效果研究較少，其安全性也尚未見于報(bào)道。

前期課題組通過大孔吸附樹脂分離純化得到延胡索總生物堿，質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá) 68.19%，其中鹽酸巴馬汀、脫氫紫堇堿、延胡索乙素及延胡索甲素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 1.95%、11.74%、4.93%、6.36%[16]。本研究擬通過急性毒性試驗(yàn)，探究延胡索總生物堿的小鼠半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50），以評(píng)價(jià)其安全性；同時(shí)采用熱板致痛試驗(yàn)和醋酸扭體試驗(yàn)初步了解延胡索總生物堿的鎮(zhèn)痛作用，為臨床應(yīng)用和新藥開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 主要儀器 JA2003N電子天平購于上海精密儀器有限公司；XS105分析天平購于梅特勒-托利多儀器有限公司；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器購于昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為上海亞榮生化儀器有限公司產(chǎn)品；DGG-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購于上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Millipore Synergy超純水系統(tǒng)為美國密理博公司產(chǎn)品。

1.2 藥品和試劑 延胡索總生物堿為本課題組自制（質(zhì)量分?jǐn)?shù)68.19%）；延胡索乙素對(duì)照品購于中國食品藥品檢定研究院（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.80%，批號(hào)：110726-201414）；冰醋酸購于天津市永大化學(xué)試劑有限公司（批號(hào)：20131006）；0.9%氯化鈉注射液購于山東齊都藥業(yè)有限公司（批號(hào)：2A15102402）；阿司匹林維生素C泡騰片購于拜耳醫(yī)藥保健有限公司（批號(hào)：BTAEEA1/2）；鹽酸嗎啡注射液購于東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司（批號(hào)：150911-1）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)ICR小鼠200只，雌雄各半，4～6 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供 [實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016]；SPF級(jí) KM 小鼠 100只，雌性，4～6周齡，體質(zhì)量（20±2）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供 [實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002]。所有小鼠均飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184]，相對(duì)濕度40%～50%，室溫 20～25℃。普通飼料喂養(yǎng)，自由攝食，充分給水。

1.4 方法

1.4.1 對(duì)照藥物配制 阿司匹林維生素C泡騰片以超純水溶解并定容，配制成終濃度為10mg·mL-1的阿司匹林溶液20mL備用。10mg·mL-1鹽酸嗎啡注射液，以0.9%氯化鈉注射液稀釋，配制成1mg·mL-1的鹽酸嗎啡注射液20mL備用。延胡索乙素對(duì)照品以超純水配制成濃度為1.5mg·mL-1的混懸液20mL備用。

1.4.2 鎮(zhèn)痛試驗(yàn)藥物劑量設(shè)置 取延胡索總生物堿原料藥，以超純水分別配制成5個(gè)不同濃度的延胡索總生物堿混懸液各20mL，含總生物堿含量分別為12、6、3、1.5、0.75mg·mL-1，分別為更高劑量組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、更低劑量組。

1.4.3 延胡索總生物堿小鼠急性毒性試驗(yàn)

1.4.3.1 預(yù)試驗(yàn) 選取ICR小鼠50只，雌雄各半，分為5組，每組10只，禁食不禁水12h后以不同劑量的延胡索總生物堿混懸液灌胃，觀察各組小鼠死亡情況，測(cè)定動(dòng)物最小全致死量 (minimum lethal dose，Dm)和最大全不致死量 (maximum non lethal dose，Dn)，確定劑量范圍。

1.4.3.2 急性毒性試驗(yàn) 選取ICR小鼠70只，雌雄各半，分7組，每組10只，灌胃前禁食不禁水12h。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定的Dn～Dm范圍，按比例配制成6組劑量梯度的延胡索總生物堿藥液各20mL備用。第1～6組小鼠分別以不同劑量的6組藥液灌胃給藥1次，給藥量為0.4mL·10g-1；第7組為正常組，灌胃等體積超純水。給藥后每日觀察，連續(xù)2周，期間正常飲食。記錄所有小鼠出現(xiàn)的癥狀及死亡情況，對(duì)試驗(yàn)期內(nèi)死亡的小鼠和試驗(yàn)結(jié)束后處死的正常組小鼠進(jìn)行尸體解剖，觀察各臟器的病理變化。以Bliss法計(jì)算小鼠LD50及95%置信區(qū)間。

1.4.4 延胡索總生物堿鎮(zhèn)痛作用研究

1.4.4.1 小鼠醋酸扭體試驗(yàn) 選取ICR小鼠80只，雌雄各半，經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成8組，每組10只，分別為：空白對(duì)照組（超純水組）、陽性對(duì)照組（阿司匹林組）、延胡索乙素組、更高劑量組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、更低劑量組，各藥物劑量分別參考1.4.1和1.4.2。各組小鼠均灌胃給藥，給藥量為0.4mL·20g-1。各組小鼠給藥后1h，經(jīng)腹腔注射0.6%冰醋酸0.2mL·20g-1，然后記錄15min內(nèi)小鼠的扭體次數(shù)，計(jì)算扭體次數(shù)抑制率[17-19]。

扭體次數(shù)抑制率（%）=（空白對(duì)照組扭體次數(shù)-各給藥組扭體次數(shù)）/空白對(duì)照組扭體次數(shù)×100%

1.4.4.2 小鼠熱板致痛試驗(yàn) 選取KM小鼠100只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，放入（55±0.5）℃的熱板中，從中篩選出合格的雌性小鼠80只（凡舔后足時(shí)間小于5s或大于30s的棄之不用）。將合格小鼠隨機(jī)分成8組，空白對(duì)照組（超純水組）、陽性對(duì)照組（鹽酸嗎啡注射液組）、延胡索乙素組、更高劑量組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、更低劑量組，每組10只，各藥物劑量分別參考1.4.1和1.4.2。鹽酸嗎啡注射液經(jīng)腹腔注射，0.2mL·20g-1，其他各組均灌胃給藥，0.4mL·20g-1。各組于給藥前重復(fù)測(cè)量痛閾3次，取平均值作為該小鼠給藥前痛閾值[11-13]。給藥后30、90、180min各測(cè)定1次痛閾值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 延胡索總生物堿小鼠急性毒性試驗(yàn) 通過預(yù)試驗(yàn)確定 Dm 為 793.88mg·kg-1，Dn 為 260.14mg·kg-1，在Dn～Dm之間按比例設(shè)置6個(gè)劑量組（793.88、635.11、508.08、406.47、325.17、260.14mg·kg-1） 進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。

按照設(shè)定的劑量一次灌胃給藥后，部分小鼠出現(xiàn)精神狀態(tài)不佳、眼眶變黑等現(xiàn)象，大約半小時(shí)出現(xiàn)抽搐、尿失禁、死亡；隨著劑量增高，此反應(yīng)加強(qiáng)；未達(dá)到致死劑量的小鼠給藥后出現(xiàn)短暫的精神倦怠現(xiàn)象，隨后活動(dòng)正常。對(duì)處死的正常組小鼠及急性毒性試驗(yàn)死亡小鼠進(jìn)行解剖可知，小鼠臟器外形、體積、色澤均正常，無充血、腫脹和壞死等異常病理表現(xiàn)。

根據(jù)急性毒性小鼠死亡率結(jié)果，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行機(jī)率單位加權(quán)回歸（Bliss法），計(jì)算得出延胡索總生物堿對(duì)小鼠經(jīng)灌胃給藥的LD50為473.36mg·kg-1，95%置信區(qū)間為 422.34～532.58mg·kg-1。見表 1。

表1 灌胃給藥急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Acute toxicity test results of intragastric administration

2.2 各組小鼠扭體反應(yīng)比較 與空白對(duì)照組比較，各給藥組對(duì)冰醋酸所致的小鼠扭體均具有顯著的抑制作用，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與阿司匹林組比較，除延胡索乙素組和延胡索總生物堿更低劑量組扭體次數(shù)增多外（P＜0.01），其他各組扭體次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與延胡索乙素組比較，除延胡索總生物堿更低劑量組外，其他各組扭體次數(shù)均減少（P＜0.01，P＜0.05）。見表 2。

2.3 各組小鼠熱板試驗(yàn)痛閾值比較 給藥前各組痛閾值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；與空白對(duì)照組比較，延胡索總生物堿更高劑量組、高劑量組、中劑量組、低劑量組給藥30、90、180min后，明顯延長(zhǎng)熱板所致小鼠的痛閾值（P＜0.01，P＜0.05）。

與鹽酸嗎啡注射液組比較，給藥30min后各給藥組痛閾值均縮短，其中延胡索乙素組、延胡索總生物堿低劑量組、更低劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01，P＜0.05）；給藥90min后延胡索總生物堿更高劑量組、高劑量組的痛閾值均較鹽酸嗎啡注射液組延長(zhǎng)，而更低劑量組痛閾值則較鹽酸嗎啡注射液組縮短，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），中劑量組、低劑量組的痛閾值與鹽酸嗎啡注射液組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；給藥180min后，除了延胡索總生物堿更低劑量組痛閾值仍然短于鹽酸嗎啡注射液組（P＜0.05），各組痛閾值與鹽酸嗎啡注射液組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

與延胡索乙素組比較，僅延胡索總生物堿更低劑量組3個(gè)時(shí)間段痛閾值短于延胡索乙素組（P＜0.05）；而延胡索總生物堿更高劑量組、高劑量組3個(gè)時(shí)間段痛閾值均長(zhǎng)于延胡索乙素組；中劑量組、低劑量組給藥30min后痛閾值也長(zhǎng)于延胡索乙素組，給藥90min與180min后痛閾值則短于延胡索乙素組，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表 3。

表2 各組小鼠扭體反應(yīng)比較Tab.2 Comparison of writhing responses in each group

表3 各組小鼠熱板致痛試驗(yàn)痛閾值比較Tab.3 Comparison of the pain threshold induced by hot plate pain test in each group

3 討論

LD50是預(yù)期引起50%動(dòng)物死亡的劑量，是評(píng)價(jià)藥物，包括從中藥、天然藥物中提取的有效部位安全性的重要指標(biāo)之一，對(duì)后期實(shí)驗(yàn)的劑量設(shè)置和制劑的制備具有重要參考價(jià)值。小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，延胡索總生物堿的LD50為473.36mg·kg-1，提示延胡索總生物堿具有一定的毒性，為后續(xù)制劑研制劑量設(shè)置提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，其長(zhǎng)期毒性還需進(jìn)一步考察研究。

醋酸扭體試驗(yàn)結(jié)果表明，延胡索總生物堿各劑量組對(duì)冰醋酸所致的小鼠扭體均具有顯著的抑制作用，且多數(shù)劑量組作用強(qiáng)于延胡索乙素組，其中在二者劑量相同的情況下，延胡索總生物堿扭體反應(yīng)抑制率較延胡索乙素提高了41.82%，提示延胡索總生物堿具有較好的鎮(zhèn)痛作用。熱板致痛試驗(yàn)結(jié)果表明，延胡索總生物堿各劑量組均能延長(zhǎng)熱板所致小鼠的痛閾值，在給藥后180min內(nèi)其痛閾值隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高再降低的趨勢(shì)，其鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)度隨給藥劑量增加而增大，但劑量達(dá)到120mg·kg-1后，延胡索總生物堿鎮(zhèn)痛作用達(dá)到平臺(tái)期，提示延胡索總生物堿的鎮(zhèn)痛作用與給藥劑量及作用時(shí)間相關(guān)。

醋酸扭體試驗(yàn)是利用化學(xué)刺激制造的疼痛模型，其主要用于評(píng)價(jià)藥物外周性鎮(zhèn)痛效果；熱板致痛試驗(yàn)是利用熱刺激篩選鎮(zhèn)痛藥的方法，主要用于評(píng)價(jià)藥物中樞性鎮(zhèn)痛效果[20]。醋酸扭體試驗(yàn)和熱板致痛試驗(yàn)結(jié)果提示，延胡索總生物堿對(duì)中樞和外周疼痛均有抑制作用，說明其在鎮(zhèn)痛方面具有獨(dú)到之處，這與延胡索總生物堿成分復(fù)雜有關(guān)，其中含多種生物堿，可能涉及多重機(jī)制，其具體機(jī)制有待后續(xù)進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果可為后期的基礎(chǔ)研究和新制劑的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。