熊果酸通過(guò)AMPK介導(dǎo)的信號(hào)通路激活自噬改善油酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪沉積

馮璐燕 應(yīng)娜 宋慶,2 竇曉兵,2

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所

3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 4.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是以肝脂質(zhì)沉積為主要病理特征的慢性肝病，進(jìn)一步可發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、甚至肝細(xì)胞癌[1]。據(jù)估計(jì)全球約有24%的成人患 NAFLD[2]，我國(guó) NAFLD 患病率約為 15%～40%[3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，NAFLD的主要病因包括過(guò)于肥胖、情志失調(diào)、過(guò)食肥甘厚味、濕熱毒邪侵入等，而久病體虛、氣滯、食積和疫氣等也與本病發(fā)生有關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為，本病的病機(jī)核心是痰瘀互結(jié)，蓄積于肝[4]。

熊果酸（ursolic acid，UA）是一種五環(huán)三萜類化合物，其廣泛存在于蘋果、蔓越莓、橄欖等多種植物中[5]，已成為人類飲食的重要組成部分。前期研究表明，UA能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD[6]，而其改善肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的機(jī)制目前尚未完全明確。因此，本研究以油酸（oleic acid，OA）誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積模型，探究UA對(duì)OA誘導(dǎo)的肝脂質(zhì)沉積的影響及其分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑 人肝癌細(xì)胞（HepG2）購(gòu)于美國(guó)培養(yǎng)物集存庫(kù)（American Type Culture Collection，ATCC）。UA、OA、棕櫚酸（palmitic acid，PA）、DMEM 培養(yǎng)基、氯喹（chloroquine，CQ）均購(gòu)于 Sigma公司（批號(hào)：89797、75090、P5585、D5796、C6628）；雷帕霉素（rapamycin，Rap）購(gòu)于 selleck 公司（批號(hào)：S1039）；Bodipy 493/503染液購(gòu)于 Invitrogen公司（批號(hào)：D2191）；胎牛血清購(gòu)于Biological industries公司（批號(hào)：04-001-1ACS）；抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）、抗磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（phospho-AMP-activated protein kinase，p-AMPK）、抗腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）抗體均購(gòu)于 Cell Signaling Technology 公司（批號(hào)：#2772、#2535、#2532）；甘油三酯（triglyceride，TG）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京普利萊基因技術(shù)有限公司（批號(hào)：E1003）；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司（批號(hào)：P0010）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗 IgG購(gòu)于Boster公司（批號(hào)：BA1054）。

1.2 主要儀器和設(shè)備 酶標(biāo)儀為美國(guó)MD公司產(chǎn)品；數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Protein Simple公司，熒光顯微鏡購(gòu)自Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放置在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，隔天換液，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞干預(yù) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以105個(gè)/mL的數(shù)量接種于24孔板內(nèi)，每孔體積1mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，設(shè)未加藥物的細(xì)胞為對(duì)照組，其余組別細(xì)胞分別予 0.25、0.5、0.75mmol·L-1的 OA 和0.25、0.5、0.75mmol·L-1的 PA 干預(yù) 16h，檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況；再分別以 0、10、20、40μmol·L-1的UA干預(yù)細(xì)胞16h后檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平。采用1μmol·L-1自噬激動(dòng)劑 Rap 及 20μmol·L-1自噬抑制劑CQ預(yù)處理細(xì)胞1h后給予OA干預(yù)16h，檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況；采用1μmol·L-1自噬激動(dòng)劑Rap及20μmol·L-1自噬抑制劑CQ預(yù)處理細(xì)胞1h后，再加入U(xiǎn)A干預(yù)2h，隨后給予OA處理16h，檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況。

1.3.3 脂質(zhì)沉積檢測(cè) 通過(guò)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TG含量和脂質(zhì)染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。分別采用TG檢測(cè)試劑盒和BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TG和蛋白質(zhì)的含量，并依據(jù)蛋白質(zhì)含量對(duì)TG含量進(jìn)行校正。脂質(zhì)染色采用Bodipy法，2μmol·L-1Bodipy于37℃染色30min，熒光顯微鏡下檢測(cè)。

1.3.4 Western blot檢測(cè) LC3B、p-AMPK、AMPK 蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，以PBS漂洗后，加入適量蛋白裂解液，冰上裂解30min，充分渦旋震蕩后，于4℃下12 000r/min離心15min，收集上清液，以BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白定量后10%SDS-PAGE電泳分離，低溫轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST液室溫封閉 1h，加入相應(yīng)的一抗（LC3B、p-AMPK、AMPK），4℃孵育過(guò)夜?；厥找豢梗琓BST洗膜3次，每次10min，再加入山羊抗兔二抗IgG，室溫?fù)u床孵育1h，回收二抗，TBST洗膜3次，每次10min，化學(xué)發(fā)光法成像，采用數(shù)字凝膠成像儀對(duì)圖像進(jìn)行拍照分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，滿足方差齊性時(shí)組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同脂肪酸對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響 分別采用不同濃度的OA和PA干預(yù)后，與對(duì)照組比較，OA和PA均呈劑量依賴關(guān)系顯著增加肝細(xì)胞內(nèi)TG含量（P＜0.05，P＜0.01）。見圖 1A。Bodipy染色觀察發(fā)現(xiàn)，OA和PA誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積結(jié)果與TG檢測(cè)結(jié)論一致。見圖1B。隨著OA和PA的濃度增加，胞內(nèi)脂滴含量顯著增加，且OA誘導(dǎo)的肝脂質(zhì)沉積效果明顯高于相同濃度的PA，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用0.5mmol·L-1OA作為干預(yù)因素。

圖1 不同脂肪酸對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響Fig.1 Effect of different fatty acids on lipid deposition of HepG2 cells

2.2 各組細(xì)胞脂質(zhì)沉積比較 采用不同濃度UA預(yù)處理細(xì)胞后，再予0.5mmol·L-1OA干預(yù)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，OA組TG含量增加明顯（P＜0.01）；與OA 組比較，UA 20、40μmol·L-1組 TG 含量減少（P＜0.05，P＜0.01），隨著劑量加大，TG含量減少更明顯。見圖2A。同時(shí)用Bodipy染色進(jìn)行觀察，提示UA以劑量依賴關(guān)系顯著改善OA所誘導(dǎo)的脂滴堆積，但與對(duì)照組比較，最大劑量（40μmol·L-1）UA 本身對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積無(wú)明顯影響。見圖2B。

圖2 各組細(xì)胞脂質(zhì)沉積比較Fig.2 Comparison of lipid deposition in each group

2.3 自噬調(diào)控OA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積 分別采用自噬激動(dòng)劑Rap和自噬抑制劑CQ進(jìn)行預(yù)處理，檢測(cè)自噬對(duì)OA誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積的影響。結(jié)果表明抑制自噬可顯著加重OA誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積，而激活自噬能顯著改善脂質(zhì)沉積情況（P＜0.05）。見圖3A。通過(guò)Bodioy染色觀察得到一致的結(jié)論，與OA組比較，CQ預(yù)處理后細(xì)胞內(nèi)脂滴含量增加，Rap預(yù)處理后細(xì)胞內(nèi)脂滴含量顯著降低。見圖3B。

圖3 自噬調(diào)控OA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積Fig.3 Autophagy modulates OA-induced lipid deposition in hepatocytes

2.4 抑制自噬對(duì)UA脂質(zhì)沉積保護(hù)作用的影響 給予不同濃度UA作用后，Western blot結(jié)果表明UA能以劑量依賴關(guān)系激活LC3BⅡ的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4A。以20μmol·L-1自噬抑制劑CQ預(yù)處理1h后再予40μmol·L-1UA處理2h，隨后添加OA處理16h，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TG含量，研究結(jié)果表明抑制自噬可顯著阻斷UA的保護(hù)作用（P＜0.05）。見圖4B。Bodipy染色觀察結(jié)果也得到一致結(jié)論。見圖4C。提示自噬信號(hào)通路參與了UA抑制OA誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積。

2.5 UA激活A(yù)MPK磷酸化 UA預(yù)處理HepG2肝細(xì)胞后，Western blot檢測(cè)提示UA能顯著提高AMPK蛋白的磷酸化水平（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，UA可顯著改善OA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積。機(jī)制研究表明UA可顯著激活肝細(xì)胞自噬，而抑制自噬可顯著阻斷UA所起到的保護(hù)作用，說(shuō)明UA通過(guò)激活自噬發(fā)揮抑制肝脂質(zhì)沉積的作用。此外，UA可顯著提高自噬調(diào)控的上游靶點(diǎn)AMPK的磷酸化水平，提示AMPK可能參與UA激活的自噬。

我國(guó)歷代醫(yī)學(xué)典籍都記載著古代醫(yī)家對(duì)“肝著”“肝癖”“積聚”等論述，其病因病機(jī)及治則治法與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)NAFLD十分相似。NAFLD其病位主要在于肝，最早相關(guān)記載見于《難經(jīng)》：“肝之積名曰肥氣……”[7]提示其與過(guò)食肥甘厚味有關(guān)；丹波元堅(jiān)[8]所著《雜病廣要》中也有“肝氣被壓……橫行之則兩脅痛”之說(shuō)，認(rèn)為偏嗜肥甘厚膩也會(huì)導(dǎo)致NAFLD發(fā)病。由此可知，脂質(zhì)是由津液、水谷所化生的精微物質(zhì)，是人體新陳代謝不可或缺的，然而其過(guò)剩的部分亦對(duì)機(jī)體造成損害。近代醫(yī)家認(rèn)為NAFLD的病機(jī)主要為肝失疏泄、肝血瘀滯等，病理基礎(chǔ)與肝臟功能關(guān)系密切[9]。前期研究顯示，UA能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD[6]，但是對(duì)UA影響脂質(zhì)沉積機(jī)制并不清楚，因此本研究通過(guò)建立脂質(zhì)沉積模型，探究UA改善肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的作用機(jī)制。

圖4 抑制自噬對(duì)UA脂質(zhì)沉積保護(hù)作用的影響Fig.4 Effect of inhibition of autophagy on protective effect of UA on lipid deposition

圖5 UA通過(guò)激活A(yù)MPK磷酸化激活自噬Fig.5 UA activates autophages by activation of AMPK phosphorylation

為探究UA對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響，本研究分別使用OA和PA對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明隨著OA和PA的濃度升高，HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量增加，兩種脂肪酸均能促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，而與PA比較，相同濃度的OA誘導(dǎo)脂質(zhì)沉積更為顯著，這與先前研究報(bào)道一致[10]，因此本研究使用OA建立脂質(zhì)沉積模型進(jìn)行后續(xù)研究。為了驗(yàn)證UA是否對(duì)OA誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積起到保護(hù)作用，在OA干預(yù)前給予不同劑量的UA預(yù)處理HepG2細(xì)胞2h，細(xì)胞內(nèi)TG含量測(cè)定及Bodipy熒光染色的結(jié)果表明，UA能夠顯著降低OA誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積，其作用呈劑量依賴關(guān)系。

現(xiàn)有研究表明，自噬在NAFLD的發(fā)展和發(fā)病過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，激活自噬可通過(guò)消除過(guò)度的肝臟脂滴和線粒體受損（分別稱為脂噬和有絲分裂），調(diào)節(jié)肥胖相關(guān)的NAFLD患者的脂質(zhì)代謝[11-12]。本研究中使用自噬激動(dòng)劑Rap及自噬抑制劑CQ分別對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，提示自噬激動(dòng)劑Rap能有效減輕OA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，而自噬抑制劑則會(huì)加重脂質(zhì)沉積的現(xiàn)象，這與目前研究一致[13]。前期研究中已證實(shí)，UA能夠通過(guò)自噬改善脂毒性誘導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡[14]，因此進(jìn)一步對(duì)UA是否能夠通過(guò)自噬減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，使用自噬抑制劑CQ進(jìn)行預(yù)處理后，UA對(duì)OA誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積的改善作用受到抑制，該結(jié)果進(jìn)一步提示UA能夠通過(guò)激活自噬改善OA誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積。

本研究進(jìn)一步對(duì)UA激活自噬的機(jī)制進(jìn)行了探究。目前研究表明，參與自噬調(diào)節(jié)的機(jī)制是多因素的[15]。而AMPK已被公認(rèn)為自噬的正調(diào)節(jié)者[16]，可作為細(xì)胞存活或死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與各種病理應(yīng)激反應(yīng)，包括氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、缺氧和滲透應(yīng)激等[17]。此外，它具有促分解代謝功能，是細(xì)胞脂質(zhì)代謝的主要調(diào)節(jié)劑，一旦被激活，AMPK能夠降低脂質(zhì)合成和相關(guān)過(guò)程中必需酶的活性。因此，本研究通過(guò)Western blot檢測(cè)UA是否能夠激活A(yù)MPK，結(jié)果顯示，UA能夠提高AMPK的磷酸化水平。該結(jié)果提示UA激活自噬可能與促進(jìn)AMPK磷酸化有關(guān)，表明UA可能通過(guò)AMPK調(diào)控自噬從而改善OA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)UA可能通過(guò)調(diào)控AMPK的磷酸化進(jìn)一步激活自噬，從而抑制OA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，該結(jié)果提示UA可作為防治NFALD的潛在藥物。