紅景天苷通過調(diào)節(jié)miR-30d-5p表達減弱大鼠心肌細胞肥大的機制研究

余平

1.浙江省立同德醫(yī)院 杭州 310012 2.浙江中醫(yī)藥大學藥學院

心力衰竭的前期通常伴隨著心臟肥大的過程，心肌肥厚和心室容量減少是心臟肥大的兩個主要標志，左心室心肌肥厚往往繼發(fā)于高血壓引起的心臟負荷增加，患者最終可發(fā)生心力衰竭[1]。近年來，心力衰竭發(fā)病率和死亡率升高的趨勢日益明顯，提高該病的防治水平勢在必行。相對于化學藥物不良反應大的弊端，天然藥物治療心力衰竭往往從抗氧化、改善微循環(huán)、擴張冠脈、增加血流量等多方面同時發(fā)揮作用[2-3]，在治療心力衰竭方面具有廣闊的應用前景。

紅景天是一種傳統(tǒng)中藥，臨床上廣泛用于治療包括心力衰竭在內(nèi)的多種心血管疾病。紅景天苷（salidroside，SAL）是紅景天最有效的活性成分之一，臨床上廣泛用于各種疾病的治療[4]。SAL作用機制多樣，能夠通過增加蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/Akt）的磷酸化，降低半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3）的活化來抑制心肌細胞凋亡[5]；還能夠通過增加缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達水平，減輕缺氧誘導的心肌細胞壞死和凋亡，并通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/Akt通路，減輕心肌缺血再灌注損傷[6-7]；SAL能夠通過調(diào)節(jié)過氧化物酶增殖物活化受體γ輔助活化因子-1α（peroxisome proliferators-activiated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）-核呼吸因子 1（nuclear respiratory factor1，NRF1）/核呼吸因子 2（nuclear respiratory factor2，NRF2）通路改善心肌線粒體呼吸功能，并通過增加細胞質(zhì)中VEGF和CD34的mRNA和蛋白水平來促進心肌損傷后的血管生成[8-9]。

微小RNA（microRNA，miR）是一類內(nèi)源性小RNA分子，能夠通過抑制翻譯或引發(fā)mRNA靶標的降解來抑制蛋白質(zhì)合成[10]。研究已證實，miR與心肌肥厚和心力衰竭的病理過程相關(guān)[11]。課題組前期篩選出了一系列改善心肌肥厚的中藥單體，其中就包括SAL。然而，SAL是否可以通過調(diào)節(jié)心肌細胞的miR表達，改善心肌肥厚仍不清楚。本研究擬觀察SAL對大鼠肥大心肌細胞中的miR表達的影響，并進一步研究對下游基因的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 Trizol、lipofectamine2000均購于Invitrogen 公司（批號：20171115、20171210）；雙熒光素酶psiCheck2報告質(zhì)粒購于Promega公司（批號：0009015）；雙熒光素酶報告基因測定試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于Thermo Fisher公司（批號：00501250、00300820）；全蛋白提取試劑盒購于Keygen公司（批號：T025413）；BCA 蛋白定量試劑盒、D-Hanks液均購于 Solarbio公司（批號：B8733、D5127）；miScript ⅡRT Kit購于 QIAGEN 公司（批號：216415）；miRcute miRNA qPCR Detection Kit購于SYBR Green公司（批號：20170110）；iScript cDNA synthesis kit購于BIO-RAD 公司（批號：1708890）；5-溴-2-脫氧尿苷（5-Bromouracil deoxyriboside，BrdU）、苯腎上腺素（phenylephrine，PE）、抗 actin抗體均購于 Sigma公司（批號：201181、202527、301137）；抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein78，GRP78）抗體、抗三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購于Abcam公司（批號：3495-1、2887-1）；免疫熒光染色試劑盒-抗小鼠Alexa Fluor 647為碧云天公司產(chǎn)品（批號：P0191）；紅景天苷購于北京世紀奧科生物科技有限公司（純度≥98%，分子式：C14H2O7，分子量：300.3，批號：160920）。

1.2 儀器 低溫離心機購于Eppendorf公司；定量PCR儀7900 HT Sequence Detection System為ABI公司產(chǎn)品；FV1000激光共聚焦顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)購于BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 心肌肥大細胞模型建立 1～3日齡SD大鼠由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。在37℃培養(yǎng)箱中以0.2%胰蛋白酶消化分離的新生大鼠心室肌細胞，離心后，以（3～5）×105的細胞密度培養(yǎng)于含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。接種24h后除去血清，以100μmol·L-1PE誘導細胞。將心肌肥大細胞模型隨機分為兩組：SAL組和模型組，SAL組以10μL·mL-1SAL處理48h，另外將正常原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞作為正常對照組。

1.3.2 心肌細胞免疫熒光染色和細胞表面積分析取無菌蓋玻片置于24孔板內(nèi)，將心肌細胞接種于蓋玻片上，在4%多聚甲醛中固定15min，以含0.1%Triton X-100的PBS透化，含5%PBS的脫脂奶粉封閉1h，再加入1:500稀釋后的actin抗體溫育過夜并以PBS洗滌3次，與二抗共孵育，PBS洗滌后安裝載玻片，激光共聚焦顯微鏡下拍攝圖像，以AxioVision 4.7.1（Carl Zeiss）軟件分析細胞表面積。

1.3.3 miR微陣列分析 miR微陣列實驗和分析由上海伯豪生物技術(shù)有限公司完成。使用Trizol試劑提取3組心肌細胞總RNA，每組設有3個復孔，通過miR微陣列（Chip ID miRRat 11.0 version，LC Sciences，Houston，TX，USA）進行分析。減去背景分析數(shù)據(jù)，使用LOWESS濾波器將信號標準化為局部回歸加權(quán)。使用3個生物學重復的平均值作為miR的表達水平，并通過Student's t檢驗進行3組間的比較。

1.3.4 miR靶基因預測 經(jīng)基因芯片篩選出模型組和SAL組中表達差異的miR，在符合要求的兩種miR中，miR-30d-5p表達差異度高于miR-199a-5p，因此選擇miR-30d-5p作為研究對象。數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址：TargetScan（http://www.targetscan.org），MiRanda（http://www.microrna.org/microrna/home.do）和 MirWalk（http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk）。

1.3.5 熒光素酶報告質(zhì)粒的構(gòu)建及熒光素酶活性分析 通過NCBI網(wǎng)站查獲miR的基因組序列，Primer 3設計含Xho1和Not1酶切位點的PCR引物，左側(cè)Xho1 引物：5'-ctcgagCGGAGCAGAGCCATGGGCACGTCTTCAG-3'，右側(cè) Not1 引物：5'-gcggccgcCCTATTGCTGGATGCTTTCCAAGTCCC-3'。按以下反應體系擴增 miR前體：2×Ex Taq 5μL、左側(cè)引物0.2μL、右側(cè)引物 0.2μL、DNA 3μL，ddH2O 1.6μL；反應條件如下：95℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 20s，共 25 個循環(huán)。用Xho1和Not1消化PCR產(chǎn)物，長度為387bp，對含有miR-30d-5p結(jié)合位點的GRP78 3’-UTR片段進行PCR擴增，引物序列：上游引物5'-GGAGTGGGTCAATTCTGTTGTCA-3'；下游引物5'-CCCGGCACTAACGTCATTC-3'。通過Real-time PCR擴增GRP78-3'UTR片段，并與psiCheck2質(zhì)粒-Report連接，以構(gòu)建psiCheck2質(zhì)粒GRP78 3'-UTR熒光素酶報告基因載體。以合成螢火蟲熒光素酶基因作為轉(zhuǎn)染對照，lipofectamine2000轉(zhuǎn)染，用含有GRP78 3'-UTR miRNA轉(zhuǎn)染的psiCheck2載體共轉(zhuǎn)染293T細胞，孵育24h后在發(fā)光計上檢測熒光素酶活性，以陰性對照RNA作為對照。

1.3.6 Real-time PCR檢測miR-30d-5p和GRP78 mRNA水平 心肌細胞總RNA的提取同前。miR-30d-5p引物序列：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACG-AACAG-3’。GRP78引物序列：上游引物5'-GGAGTGGGTCAATTCTGTTGTCA-3’；下游引物5'-CCCGGCACTAACGTCATTC-3’。逆轉(zhuǎn)錄反應條件 25℃ 5min，42℃ 30min，85℃ 5min；PCR過程按qPCR試劑盒說明書在熒光定量PCR儀上進行。PCR反應條件：95℃5min，95℃ 10s，60℃ 30s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，獲得Ct值后，應用比較Ct法進行相對定量，目標基因的相對表達量按2-ΔΔCt計算。

1.3.7 心肌細胞轉(zhuǎn)染 細胞培養(yǎng)同1.3.1。lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染，按照指示miR最終濃度為400ng/孔。轉(zhuǎn)染24h后，將原始培養(yǎng)基替換為不含血清的DMEM培養(yǎng)基。將細胞分為6組：陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照RNA的正常心肌細胞）、PE+陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照RNA的PE誘導后心肌細胞）、miR-30d-5p模擬物組（轉(zhuǎn)染miR-30d-5p模擬物的PE誘導后心肌細胞）、miR-30d-5p抑制物組（轉(zhuǎn)染miR-30d-5p抑制物的PE誘導后心肌細胞）、miR-30d-5p模擬物+SAL組（轉(zhuǎn)染miR-30d-5p模擬物的PE誘導后心肌細胞，并以SAL 10μL·mL-1處理）和miR-30d-5p抑制物+SAL組（轉(zhuǎn)染miR-30d-5p抑制物的PE誘導后心肌細胞，并以SAL 10μL·mL-1處理）。轉(zhuǎn)染24h后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)以含有新鮮胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。

1.3.8 Western blot檢測蛋白表達 以蛋白提取試劑盒提取各組心肌細胞總蛋白，測定總蛋白濃度后，加入上樣緩沖液煮沸3min變性，經(jīng)SDS/PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉后分別與1:1 000稀釋的一抗（抗GRP78抗體和抗GAPDH）4℃孵育過夜，與1:5 000稀釋的相應二抗在室溫下孵育2h，ECL化學發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，對結(jié)果進行灰度掃描分析。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。所有計量資料均采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細胞表面積比較 心肌細胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，PE處理后心肌細胞發(fā)生肥大，與正常對照組比較，模型組細胞表面積增大約31%（P＜0.01）；與模型組比較，SAL組心肌細胞表面積減小約15.3%（P＜0.01）。見圖 1。

2.2 microRNA微陣列分析 與正常對照組比較，模型組中14種miR表達差異明顯，其中5種上調(diào)、9種下調(diào)；與模型組比較，SAL組中10種miR表達差異明顯，其中7種上調(diào)、3種下調(diào)。模型組miR-30d-5p表達量顯著低于正常對照組和SAL組（P＜0.01），而SAL組miR-30d-5p表達量與正常對照組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見圖 2。說明 miR-30d-5p下調(diào)可能是導致心肌肥大的機制之一，而SAL能夠抑制miR-30d-5p下調(diào)。

圖1 心肌細胞免疫熒光染色結(jié)果Fig.1 Myocardial immunofluorescence staining results

圖2 miR微陣列分析結(jié)果Fig.2 MiR microarray analysis results

2.3 生物信息學方法和雙熒光素酶報告基因測定結(jié)果 生物信息學方法確定miR-30d-5p的潛在靶基因為GRP78，在GRP78 mRNA的3'-UTR中進行miR-30d-5p一個結(jié)合位點的鑒定，見圖3A。PE誘導后，與正常對照組比較，模型組中miR-30d-5p水平降低 0.4倍（P＜0.05）；與模型組比較，SAL組中 miR-30d-5p表達增加了0.4倍（P＜0.05）。見圖3B。Realtime PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型組GRP78 mRNA 表達顯著增加 （P＜0.05）；SAL 組GRP78 mRNA 表達低于模型組（P＜0.05），但與正常對照組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3C。采用雙熒光素酶報告基因測定驗證miR-30d-5p和GRP78之間的關(guān)系，提示與陰性對照組比較，與GRP78 3'-UTR融合的熒光素酶報告基因表達被miR-30d-5p模擬物抑制了31%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖3D。證實 miR-30d-5p通過其 3'抑制GRP78表達。Western blot結(jié)果也顯示，miR-30d-5p組GRP78表達下調(diào)，而抗miR-30d-5p組GRP78表達上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖3E、3F。上述結(jié)果表明，miR-30d-5p可直接靶向調(diào)節(jié)GRP78的表達。

圖3 生物信息學方法和雙熒光素酶報告基因測定結(jié)果Fig.3 Results of bioinformatics method and dual luciferase reporter gene assay

與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-30d-5p模擬物后miR-30d-5p的表達水平顯著增加（P＜0.01）。見圖4A。Real-time PCR分析結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，分別用miR-30d-5p模擬物或miR-30d-5p抑制物轉(zhuǎn)染48h后，再用10μL·mL-1的SAL處理心肌細胞，miR-30d-5p的表達水平分別增加3.3倍和3.14倍（P＜0.01）。見圖4B。GRP78 mRNA水平分別下調(diào)了 55%和 53%（P＜0.01）。見圖 4C。

圖4 miR-30d-5p模擬物或miR-30d-5p抑制物轉(zhuǎn)染48h結(jié)果Fig.4 Results of miR-30d-5p mimics or miR-30d-5p inhibitor transfection for 48h

2.4 各組GRP78蛋白表達比較 與正常對照組比較，模型組GRP78蛋白表達顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，SAL組GRP78蛋白表達顯著降低（P＜0.01），SAL和正常對照組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖5A、B。心肌肥大細胞模型經(jīng)miR-30d-5p模擬物轉(zhuǎn)染后，GRP78蛋白表達顯著下降（P＜0.01）；經(jīng)miR-30d-5p抑制物轉(zhuǎn)染后，GRP78蛋白表達顯著增加（P＜0.01）。SAL處理后，與PE+陰性對照組比較，GRP78蛋白表達顯著降低（P＜0.01）。見圖 5C、D。

3 討論

SAL是中藥紅景天最有效的活性成分之一，化學名為對羥基苯乙基-β-D葡萄糖苷，其苷元為對羥基苯乙醇。SAL主要來源于紅景天屬、越桔屬、杜鵑花屬、女貞屬等多種植物，為無色透明針狀結(jié)晶[12]。研究證實，SAL具有心臟保護、抗疲勞、抗壓力、抗抑郁、抗焦慮、提高神經(jīng)功能及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種功效[13]。

miR是長度為20～24個核苷酸的非編碼RNA家族[11]。本實驗首次從miR的角度系統(tǒng)性研究了SAL在調(diào)節(jié)心肌細胞肥大中的作用機制。結(jié)果表明，PE誘導的心肌細胞肥大與兩類不同的miR改變有關(guān)，這兩類miR對心肌細胞具有相反的表型效應。本研究的結(jié)果為SAL調(diào)節(jié)肥大心肌細胞中的miR表達提供了明確證據(jù)。其中，最顯著的變化是模型組中的miR-30d-5p表達下調(diào)，而SAL可以抑制這種下調(diào)。通過生物信息學算法、雙熒光素酶報告基因檢測和Real-time PCR鑒定明確miR-30d-5p的靶基因為GRP78。

圖5 各組GRP78蛋白表達比較Fig.5 Comparison of the expression of GRP78 protein in each group

心臟是一種高度塑化的器官，隨著生理或病理需求的變化而擴大或收縮。當心室肥大時，心臟會擴張，收縮功能下降，因而導致心衰[14]。心臟肥大是心肌細胞對各種刺激的補償反應，主要病理變化是心肌細胞體積增大和心肌細胞蛋白質(zhì)合成增加[15-16]。GRP78又稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（immuno-globulin heavy chain binding protein，Bip），屬于熱休克蛋白 70 家族的一員，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上重要的分子伴侶[17]。GRP78分子及其DNA序列結(jié)構(gòu)在許多生物物種中高度保守[18]。GRP78參與阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)新生肽聚集、調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)、抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細胞凋亡，以及啟動未折疊蛋白反應等細胞生命過程[19]。既往研究證實，GRP78參與的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）過程與心肌肥大相關(guān)[20-21]。本研究結(jié)果提示，模型組中GRP78的蛋白表達顯著增加，GRP78是miR-30d-5p的靶基因，miR-30d-5p上調(diào)可以抑制心肌細胞中GRP78 mRNA和蛋白質(zhì)的表達，miR-30d-5p下調(diào)則可以促進GRP78的表達，提示GRP78介導的ERS信號低表達可能是心肌細胞肥大的原因，而SAL可以逆轉(zhuǎn)這一過程。

綜上所述，本研究初步證實miR-30d-5p具有抑制心肌肥大的作用，SAL可能通過增加心肌細胞中miR-30d-5p的表達，降低GRP78 mRNA及蛋白表達，從而改善心肌肥大。該研究結(jié)果有助于更好地了解SAL在心肌細胞肥大治療中的潛在機制。