李軍勝，劉麗芳

(1.麗水市婦幼保健院新生兒科，浙江 麗水 323000；2.麗水市婦幼保健院兒童保健科，浙江 麗水 323000)

窒息是新生兒致殘和致死的主要原因之一，可導(dǎo)致腦、心臟、肝臟和胃腸等多個器官的功能損害[1]，使得臟器和組織出現(xiàn)缺氧、缺血，從而導(dǎo)致機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，其中新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)最為多見[2-3]。本研究檢測了窒息對新生兒血清糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)、褪黑素(melatonin，MT)、糖皮質(zhì)激素受體(GR-α mRNA)和褪黑素受體(MR-1 mRNA)的表達(dá)，旨在為揭示MT與下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸的相關(guān)性提供研究基礎(chǔ)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月至2017年12月麗水市婦幼保健院收治的足月窒息新生兒90例作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①孕37～40周分娩；②日齡為0～1d；③新生兒體重為2 500～4 000g；④新生兒窒息符合中華醫(yī)學(xué)會圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)分會新生兒復(fù)蘇學(xué)組制定的《新生兒窒息診斷的專家共識》[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①孕母為妊娠期高血壓疾病、妊娠期糖尿病和代謝性疾病等；②胎兒宮內(nèi)發(fā)育良好；③圍產(chǎn)期抑郁癥。

根據(jù)Apgar評分[4]將90例新生兒分為輕度窒息組(Apgar評分為4～7分，n=41)和重度窒息組(Apgar評分為0～3分，n=49)。另外，選擇同期在本院分娩的40例非窒息健康足月新生兒作為對照組。本研究已通過我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有新生兒監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2 新生兒窒息的治療

一般支持治療：維持水電解質(zhì)和酸堿平衡，控制血糖和血壓；降顱壓：用20%甘露醇和呋塞米治療；控制驚厥：用苯巴比妥治療，負(fù)荷劑量為20mg/kg，12h后維持5mg·kg-1·d-1；營養(yǎng)腦細(xì)胞：單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液。

保持環(huán)境舒適，入院時放置在環(huán)境設(shè)備配備一致、無陪護(hù)的新生兒室，除非必要檢查，否則不帶出病房。

1.3 標(biāo)本的采集

新生兒出生24h內(nèi)和第7天時，采集新生兒晨起肘靜脈血5mL置于EDTA管中，2h內(nèi)低溫離心(2 000r/min)15min，取上清待測，置于-70℃冰箱保存。

1.4 方法

1.4.1 血清GC和MT水平的檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清中GC和MT的濃度[5]，試劑盒購于上海篤瑪生物科技有限公司，批號分別為DM00436和DMX0601。檢測步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，做3個副孔，最后在elx800酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)上檢測，波長設(shè)置為450nm。檢測完成后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)OD值求樣本濃度。

1.4.2 GR-α mRNA和MR-1 mRNA的檢測

采用實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)檢測mRNA的表達(dá)情況。①外周血中單個核細(xì)胞的提取。采用PBS緩沖液按1∶1稀釋離心血，加入淋巴細(xì)胞分離液(批號P8610，索萊寶)4mL，離心(1 500r/min)30min，取上層液(白色云霧狀)，加入2倍體積的PBS，離心(1 500r/min)10min，棄去上清液，加入TRIZOL 1mL，混勻待測。②單個核細(xì)胞mRNA的提取。將單個核細(xì)胞混合液離心(12 000r/min)5min，取上清加入氯仿200μL，振蕩15s，靜置5min，離心(12 000r/min)10min，吸取上層水相加入異丙醇500μL，冰上靜置10min，離心(12 000r/min)10min，棄上清，加入75%乙醇1mL混合，離心(8 000r/min)5min，棄上清，加入無水乙醇1mL混勻，再離心(8 000r/min)5min，棄上清，溫室晾干。③mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物由天根生化科技(北京)有限公司設(shè)計并提供，見表1。PCR反應(yīng)體系為2xSYBR PCR minister Mix(10μL)、引物(0.5μL)、Deionized water(7μL)和cDNA(2μL)。PCR反應(yīng)條件：第1步，95℃ 30s；第2步，95℃ 5s、60℃ 20s，共40個循環(huán)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，繪制熔解曲線，以2-ΔΔCt值表示miR-124的相對表達(dá)水平[6]。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料的比較

三組一般資料的比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，說明組間可比，見表2。

表2 三組一般資料的比較結(jié)果

2.2 各組血清GC、MT、GR-α mRNA和MR-1 mRNA表達(dá)水平的比較

對照組出生24h內(nèi)與出生第7天血清GC、MT、GR-α mRNA、MR-1 mRNA的表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；輕度窒息組出生第7天與出生24h內(nèi)比較，血清GC，GR-α mRNA水平顯著下降，血清MT，MR-1 mRNA水平顯著上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；重度窒息組出生第7天與出生24h內(nèi)比較，血清GC水平顯著降低，MT、GR-α mRNA和MR-1 mRNA水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表3。

表3 血清GC、MT濃度和GR-α mRNA、MR-1 mRNA表達(dá)水平的比較結(jié)果

注：*為三組出生24h內(nèi)的比較；**為三組出生第7天的比較。

組間兩兩比較采用LSD檢驗：

在出生24h內(nèi)，輕度窒息組與對照組相比，血清GC、GR-α mRNA、MR-1 mRNA水平均顯著升高(P值分別為0.000、0.000、0.000)，MT水平顯著降低(P=0.000)；在出生第7天，輕度窒息組與對照組相比，血清MT、MR-1 mRNA水平均顯著升高(P值分別為0.000、0.000)，GC和GR-α mRNA水平與對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.484，0.444)。

在出生24h內(nèi)，重度窒息組與對照組相比，GC和MR-1 mRNA水平均顯著高于對照組(P值分別為0.000、0.000)，MT和GR-α mRNA水平均顯著低于對照組(P值分別為0.000、0.000)；在出生第7天，重度窒息組與對照組相比，血清GC、MT、MR-1 mRNA水平均顯著高于對照組(P值分別為0.000、0.000、0.000)，兩組GR-α mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.387)。

在出生24h內(nèi)，重度窒息組與輕度窒息組相比，GC和MR-1 mRNA水平均顯著高于輕度窒息組(P值分別為0.000、0.000)，MT和GR-α mRNA水平均顯著低于輕度窒息組(P值分別為0.000、0.000；在出生第7天，重度窒息組與輕度窒息組相比，血清GC、MT、MR-1 mRNA水平均顯著高于輕度窒息組(P值分別為0.000、0.000、0.000)，兩組GR-α mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.462)。

3 討論

3.1 HPA軸與MT、MR的關(guān)系

重度HIE常引起新生兒死亡，存活者多遺留癲癇、精神發(fā)育遲滯等后遺癥，給家庭和社會帶來了沉重負(fù)擔(dān)[7]。目前窒息所致HIE的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。機(jī)體受到應(yīng)激時，HPA軸會激活，促進(jìn)GC的分泌和釋放，從而產(chǎn)生一系列的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，以避免組織損傷，而缺血缺氧會使HPA軸調(diào)節(jié)紊亂[8]。GC分泌具有節(jié)律性，最高濃度在6∶00—8∶00時出現(xiàn)，此后逐漸減少，最低濃度出現(xiàn)在22∶00—2∶00時，然后逐漸增加[9]。這恰好與松果體分泌的褪黑素MT的節(jié)律相反[10-11]?？梢奙T與HPA軸有一定的相關(guān)性。根據(jù)Yang等[12]的動物研究發(fā)現(xiàn)，中重度腦損傷后機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，血清中GC水平升高、GR-α和MR-1表達(dá)下降，這不利于機(jī)體對抗應(yīng)激，而使用外源性MT干預(yù)可緩解這種狀態(tài)[13]。

3.2 窒息對GC和GR-α的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，出生24h內(nèi)輕度窒息組新生兒血清GC水平高于對照組，而重度窒息組高于輕度窒息組和對照組，提示窒息可使新生兒機(jī)體HPA軸處于興奮狀態(tài)，并且興奮性可能與窒息的嚴(yán)重程度有關(guān)；而第7天時，輕度窒息組GC與對照組比較無差異，而重度窒息組GC雖然較出生24h內(nèi)有所下降，但其水平仍高于對照組和輕度窒息組，結(jié)果表明輕度窒息新生兒經(jīng)過治療后應(yīng)激可能恢復(fù)至正常水平，而重度窒息可能對新生兒的損傷較為嚴(yán)重，HPA處于持續(xù)激活狀態(tài)，使機(jī)體分泌更多的GC以保護(hù)組織。

通過采用實時定量PCR技術(shù)檢測GR-α mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)輕度窒息組出生24h內(nèi)GR-α mRNA水平明顯較對照組高，而重度窒息組則較對照組和輕度窒息組低；第7天時，輕度窒息組和重度窒息組GR-α mRNA水平與對照組相當(dāng)，這與HPA的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)[14-15]，這與王瑩等[16]研究結(jié)果一致。

3.3 窒息對MT和MR-1 mRNA的影響及本次研究的局限性

本研究發(fā)現(xiàn)，出生24h內(nèi)輕度窒息組和重度窒息組的MT明顯較對照組低，第7天時均明顯升高。輕度窒息組和重度窒息組的MR-1 mRNA在出生24h內(nèi)和第7天時均高于對照組，結(jié)果提示機(jī)體可能利用MT來抗應(yīng)激，抑制GR-α mRNA，緩解HPA軸調(diào)節(jié)紊亂。Olegário等[17]對49例遭受圍生期應(yīng)激的小兒進(jìn)行尸檢，發(fā)現(xiàn)腦組織中MR表達(dá)水平升高，并且其表達(dá)水平與白細(xì)胞介素-1和C-反應(yīng)蛋白呈正相關(guān)，說明MT可能參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。

本研究的局限性在于：①本資料為觀察性研究，未對機(jī)制進(jìn)行研究；②僅從RNA水平進(jìn)行檢測，未檢測蛋白；③新生兒窒息的治療未嚴(yán)格控制，個體治療的差異性可能影響研究結(jié)果。

3.4 結(jié)語

綜上，窒息使新生兒機(jī)體HPA軸激活，重度窒息使HPA軸發(fā)生紊亂。MT和MR-1 mRNA可能通過調(diào)節(jié)HPA軸發(fā)揮抗應(yīng)激作用，未來需要進(jìn)一步進(jìn)行機(jī)制研究。