徐波 牛濤 陳紅 張學(xué)敏

（天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司 天津 300410）

芪參益氣滴丸主要用于治療心肌損傷、心功能減退、心肌梗死等疾病。處方中含有四味中藥，分別為黃芪：補(bǔ)元?dú)?，使氣旺以促血行，祛疲而不傷正，氣旺以促津行，具有帥諸藥之力；丹參及三七：活血祛疲，通絡(luò)止痛，共為臣藥；降香：氣香辛散、溫通行滯；四味藥合用具有益氣活血、通絡(luò)止痛之功效[1]。

黃芪提取物為芪參益氣滴丸的制劑中間體，主要含有黃酮類和皂甙類等成分[1]。其中黃酮類成分主要為異黃酮，研究表明異黃酮對人體生理代謝有益的調(diào)節(jié)功能[2]。本論文建立了黃芪中四種主要異黃酮成分的含量測定方法，并進(jìn)行了方法驗(yàn)證。

1.實(shí)驗(yàn)用品

1.1 儀器

Acquity UPLC超高效液相色譜儀，紫外檢測器，Empower3化學(xué)工作站（美國Waters公司)；AG104電子天平（瑞士METTLER 公司）；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（美國MILLIPORE公司）。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮葡萄糖苷(111920-201501)、芒柄花素(111703-201202）對照品購自中國食品藥品檢定研究院；毛蕊異黃酮、芒柄花苷對照品購自天津一方科技有限公司(歸一化法測定，含量≥98%)。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。黃芪提取物由天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司提供。

2.方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱，以0.2%甲酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫程序，流速為0.4mL/min；檢測波長：254nm，見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品圖譜（a）和黃芪提取物圖譜（b）

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別取毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，加甲醇配制成每毫升含毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分別為0.01mg、0.04mg、0.004mg和0.15mg的溶液。取2ul,注入液相色譜儀，記錄峰面積。

2.3 樣品溶液的制備

取黃芪提取物約0.2克，精密稱定，加70%甲醇溶液適量，超聲溶解，加70%甲醇至25毫升，搖勻，取2ul,注入液相色譜儀，記錄峰面積。外標(biāo)法計(jì)算含量。

3.方法學(xué)驗(yàn)證

3.1 線性關(guān)系考察

精密稱取毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷對照品適量，加甲醇配制成每毫升含毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分別為0.1mg、0.4mg、0.04mg和1.5mg的混合對照溶液，再分別取量取0.5、1、2、4、5、10ml混合對照溶液置于50ml量瓶中，加水至刻度，混勻，制成系列溶液，注入液相色譜儀，測定，以對照品濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo)(X),相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立回歸方程，見表2。

表2 回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

3.2 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取上述供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷的峰面積，峰面積的RSD分別為0.27%、0.16%、0.39%和0.70%，結(jié)果表明進(jìn)樣精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣，記錄毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷的峰面積，峰面積的RSD分別為1.19%、0.29%、2.13%和1.18%，結(jié)果顯示供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取黃芪提取物6份，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷的平均含量分別為0.037%、0.216%、0.021%和0.953%，RSD分別為0.90%、1.02%、0.36%和0.93%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

3.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的黃芪提取物6份，每份約0.25g，分別精密加入混合對照品溶液 (每毫升含毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素分別約為0.02mg、0.11 mg 、0.45mg和0.01mg) 5ml，自“加70%甲醇溶液適量，超聲溶解”起，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，取2ul注入色譜儀，分別計(jì)算毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素的回收率，見表3。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（%，n=6）

3.6 樣品的測定

取不同批次的黃芪提取物，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法計(jì)算4種黃酮成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品測定結(jié)果（n=6）

4.討論

4.1 采用超高效液相色譜法進(jìn)樣，能夠在8分鐘內(nèi)完成四種黃酮類成分的有效分離，有效提高了分析效率。

4.2 應(yīng)用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱，本色譜柱的碳鏈鍵合密度低，使分析物能更容易進(jìn)入顆粒材料的孔結(jié)構(gòu)中，為極性和疏水性分子提供均衡的保留性能而，能夠使單一色譜方法用于分析多種不同極性的成分，且無需使用離子對試劑。而黃芪提取物中的黃酮成分極性差別很大，使用HSS T3色譜柱保證了各成分的色譜分離度。

4.3 分別以0.1%、0.2%、0.5%甲酸水溶液為流動相A進(jìn)樣測定，色譜圖顯示，0.1%甲酸水溶液為流動相A時(shí)，黃酮成分的色譜峰峰形較差，分離度偏低，0.2%、0.5%甲酸水溶液為流動相A的色譜峰峰形及分離度較好，考慮試驗(yàn)條件的溫和性，采用0.2%甲酸水溶液為流動相A。