吳雯娟 劉國華 陳俊萍 徐少華 譚磊

摘 ?要：本文建立了豬尿中15種磺胺類藥物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）分析方法。15種磺胺類藥物殘留在線性范圍2.00 μg/L～500.00 μg/L內(nèi)的r值在0.999 6以上，方法檢出限均在0.333 μg/L以下，2.00 μg/L、6.00 μg/L、100.0 μg/L 3個(gè)水平的陽性添加回收率范圍在94.2%～104.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.1%～10.6%之間，具有較好的精密度和準(zhǔn)確度，滿足檢測要求。方法簡單、快速、準(zhǔn)確，可適用于尿液中15種磺胺類藥物殘留的檢測。

關(guān)鍵詞：磺胺;殘留;豬尿;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號：S859.84 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-0769（2019）08-0069-05

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）是指具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中常用的一類抗菌藥物，具有廣譜、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、易用等特點(diǎn)，可用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病，常配合抗菌增效劑以作為飼料添加劑，來預(yù)防疾病的發(fā)生和促進(jìn)動物生長[1]。臨床研究表明，磺胺類藥物在體內(nèi)的代謝時(shí)間較長，長期使用可能在人體中蓄積，導(dǎo)致人體機(jī)能損害，誘使病原體產(chǎn)生抗藥性[2]。另外，磺胺類藥物半衰期較短，但由于頻繁地被使用并進(jìn)入環(huán)境，形成環(huán)境中抗生素的“假持續(xù)”現(xiàn)象，對人體安全及整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成了長期的潛在風(fēng)險(xiǎn)[3]?！吨腥A人民共和國農(nóng)業(yè)部公告》第235號公告（2002）規(guī)定了磺胺類總量在所有動物的肌肉、脂肪、肝、腎和奶中最高殘留限量為100 μg/kg，磺胺二甲嘧啶在牛奶中的最高殘留限量為25 μg/kg[4]。2017年，農(nóng)業(yè)部印發(fā)了《全國遏制動物源細(xì)菌耐藥行動計(jì)劃 ? ? ? ? ?（2017—2020年）》，針對促生長用抗菌藥物，將積極穩(wěn)妥地推動實(shí)施“退出行動”。可見抗菌類藥物濫用的問題已引起社會各界的高度關(guān)注。

目前，我國對磺胺類藥物殘留的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、膠體金法、液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法以及超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法等[5-10]，基質(zhì)主要為農(nóng)產(chǎn)品可食用部分，缺少尿液中的檢測方法，導(dǎo)致在抽取農(nóng)產(chǎn)品樣品檢測時(shí)，多半已處于流通待售環(huán)節(jié)，具有滯后性，影響市民的肉食安全。本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），建立了豬尿中15種磺胺類藥物殘留簡便、快速、高效的檢測方法，可以為生豬屠宰入市之前提供豬尿中磺胺類藥物殘留檢測依據(jù)，防止被磺胺類藥物污染的生豬流入市面，對維護(hù)人民健康具有重要意義。

1 ?材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

取豬尿液，離心取上清，4 ℃保存。

1.2 儀器與設(shè)備

AB Sciex Triple QuadTM 4500質(zhì)譜儀、N-EVAP-24型全自動氮吹儀、多管漩渦混合儀（杭州奧盛儀器有限公司）、梅特勒PL602E型天平、Sigma 3K15冷凍離心機(jī)和Milli-Q Integral 3型超純水儀。

1.3 主要試劑與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純。

復(fù)溶液：甲醇/水/甲酸（10∶90∶0.09，v/v/v）。

磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine，SM2）、磺胺喹噁啉（Sulfaquinoxaline，SQX）、磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SD）

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：磺胺類藥物[磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine，SM2）、磺胺甲氧噠嗪（Sulfamethoxypyridazine，SMP）、磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺氯噠嗪（Sulfachloropyridazine，SCP）、磺胺吡啶（Sulfapyridine，SMPD）、磺胺苯吡唑（Sulfaphenazole，SPP）、磺胺甲惡唑（Sulfamethoxazole，SMZ）、磺胺地索辛（Sulfadimethoxine，SDM）、磺胺醋酰（Sulfacetamide，SA）、磺胺二甲異惡唑（Sulfisoxazole，SIZ）、磺胺噻唑（Sulfathiazole，ST）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（Sulfadimoxine，SDM）、磺胺對甲氧嘧啶（Sulfametoxydiazine，SMD）、磺胺笨酰（Sulfabenzamide，SB）、磺胺二甲唑（Sulfamoxol）]均為德國Dr. Ehrenstorfer。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：準(zhǔn)確稱取15種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇分別配成約1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液， 放入-18 ℃冰箱中保存。

1.5 試驗(yàn)方法

量取1.00 mL試樣置于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈和5.0 g無水硫酸鈉，充分渦旋震蕩10 min，9 000 r/min離心5 min。移取5.00 mL上清液置于15 mL離心管中，50 ℃水浴氮吹近干。加入1.00 mL復(fù)溶液，過0.22 μm濾膜，供液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.6 儀器條件

1.6.1 高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）;流動相A相為0.1%甲酸水溶液;流動相B相為甲醇;柱溫為40 ℃;進(jìn)樣量5.0 μL。梯度洗脫程序見表 1。

1.6.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源，掃描方式為正離子掃描，檢測方式是多反應(yīng)監(jiān)測，電噴霧電壓為5 500 V，離子源溫度為 600 ℃，氣簾氣壓力采用30 psi，碰撞氣壓力為8 psi，霧化氣壓力為60 psi，輔助加熱氣壓力為65 psi。

定性離子對、定量離子對、采集時(shí)間、去簇電壓及碰撞能量見表2，空白基質(zhì)及添加藥物樣本色譜圖見圖1。

2 ?結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密量取磺胺類藥物（SM2、SMP、SMM、SCP、SMPD、SPP、SMZ、SDM、SA、SIZ、ST、SDM、SMD、SB、Sulfamoxol）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加到6份1.00 mL空白尿液中，制得濃度分別為2.00 μg/L、5.00 μg/L、10.0 μg/L、50.0 μg/L、100 μg/L和500 μg/L的各系列空白添加試樣，按1.5試驗(yàn)方法處理試樣，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，各化合物的濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。15種磺胺類藥物基質(zhì)試驗(yàn)的線性范圍在2.00 μg/L～ ?600 μg/L內(nèi)，峰面積與相應(yīng)回收濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）均在0.999 6以上。

2.2 方法檢出限確定

取空白豬尿樣品，添加濃度為2.00 μg/L，按照1.5試驗(yàn)方法進(jìn)行處理和測定，平行樣本數(shù)n=7，根據(jù)各樣本檢測值計(jì)算出平均值（x）及標(biāo)準(zhǔn)偏差（Sb），再根據(jù)公式檢出限（MDL）=（k×Sb×C）/x（其中：k為置信因子，一般取3），計(jì)算出SM2、SMP、SMM、SCP、SMPD、SPP、SMZ、SDM、SA、SIZ、ST、SDM、SMD、SB和磺胺二甲基惡唑（sulfamoxol）的檢出限分別為0.200 μg/L、0.175 μg/L、0.210 μg/L、 ? 0.159 μg/L、0.183 μg/L、0.333 μg/L、0.286 μg/L、0.220 μg/L、0.090 μg/L、0.329 μg/L、0.172 μg/L、0.145 μg/L、 ? ? ? 0.171 μg/L、0.146 μg/L和0.106 μg/L。15種磺胺類藥物的檢出限均在0.333 μg/L ?以下。

2.3 回收率測定

以空白尿樣為基質(zhì)，進(jìn)行2.00 μg/L、 ?6.00 μg/L、100 μg/L 3個(gè)水平的陽性添加回收試驗(yàn)，每個(gè)水平取6個(gè)平行樣，按1.5試驗(yàn)方法進(jìn)行處理和測定。15種磺胺類藥物的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表4。15種磺胺類藥物在2.00 μg/L、6.00 μg/L、100 μg/L 3個(gè) ?水平的陽性添加回收率范圍在94.2%～104.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.1%～10.6%之間。

3 ?結(jié)論

方法建立了豬尿中15種磺胺類藥物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。樣本經(jīng)過提取、凈化，有效地消除了基質(zhì)干擾，方法具有較高的靈敏度，且操作簡單便捷。經(jīng)過優(yōu)化試驗(yàn)驗(yàn)證，該方法簡單、快捷和易操作，可大大縮短檢測時(shí)間，節(jié)約人力物力，能有效消除基質(zhì)干擾，具有較好的精密度和準(zhǔn)確度，滿足檢測要求，適用于尿液中15種磺胺類藥物殘留的檢測。方法將檢測基質(zhì)從“肌肉”改為“尿液”，實(shí)現(xiàn)監(jiān)控點(diǎn)前移，在養(yǎng)殖過程中和屠宰前即可實(shí)施磺胺類藥物檢測，保障出欄食品動物質(zhì)量，確保殘留超標(biāo)的畜產(chǎn)品不會進(jìn)入市民餐桌，對從源頭上切實(shí)保障市民的肉食安全，具有重要意義。□□

參考文獻(xiàn)：（10篇，略）