燃料乙醇生料發(fā)酵技術現(xiàn)狀

俞建良，熊 強，張永新，劉勁松，林海龍

（國投生物科技投資有限公司，北京 100084）

生物燃料乙醇是以可再生的生物質為原料制成可作為燃料使用的乙醇，以其為代表的生物能源是關乎農業(yè)、能源、環(huán)境和區(qū)域經濟的國家戰(zhàn)略性新興產業(yè)[1]。2017年9月，國家發(fā)展改革委、國家能源局等十五部門聯(lián)合印發(fā)《關于擴大生物燃料乙醇生產和推廣使用車用乙醇汽油的實施方案》，標志著我國生物燃料乙醇正式由試點推廣進入全面推廣新階段。我國生物燃料乙醇產業(yè)的發(fā)展既面臨千載難逢的歷史發(fā)展機遇，也面臨著來自各方的嚴峻挑戰(zhàn)。通過技術創(chuàng)新，實現(xiàn)降本增效，是我國生物燃料乙醇行業(yè)不斷發(fā)展壯大、有效應對國內外市場沖擊的最重要途徑之一。

酒精生料發(fā)酵技術，因為工藝簡單、能耗低、產品得率高等原因，一直是國內外研究的熱點和重點發(fā)展方向之一，本文將從決定酒精生料發(fā)酵技術能否推廣應用的幾個關鍵技術環(huán)節(jié)（粉碎預處理、生淀粉水解、發(fā)酵、染菌防治、蒸餾及DDGS 顏色）對國內外酒精生料發(fā)酵技術的研究進行綜述，從而為該項技術的開發(fā)提供思路。

1 研究概況

酒精生料發(fā)酵是指在低于淀粉糊化的溫度下，用生料淀粉水解酶與酵母共同作用于淀粉質原料而生產酒精的方法。與傳統(tǒng)蒸煮法酒精生產工藝相比，生料發(fā)酵過程省去了高溫蒸煮的過程，降低了能耗，減少了淀粉在高溫蒸煮過程中所造成的損失（形成淀粉脂肪復合體、美拉德反應、淀粉回生等）[2]，因此可以提高淀粉酒精轉化率。美國最大的生料酒精生產公司POET 的長期生產經驗表明，與傳統(tǒng)蒸煮法酒精生產工藝相比，綜合能耗下降8 %～15 %，酒精得率提高12～18 kg/t 玉米。另外，生料發(fā)酵工藝簡單，可有效的降低生產成本和勞動強度。因此，酒精生料發(fā)酵技術具有很高的推廣和應用價值。

生料發(fā)酵技術的核心是獲得高效的生料水解酶，即能在正常發(fā)酵溫度下高效降解生淀粉，轉化為酵母能利用的單糖。目前，已經大規(guī)模商業(yè)化的能滿足生料發(fā)酵要求的生料水解酶主要有諾維信公司的Novozyme5009 和杰能科的Stargen。同時，還需要解決未經蒸煮的原料在發(fā)酵過程中容易出現(xiàn)的染菌問題[3]，由于生料淀粉原料顆粒度細導致的廢醪液固液分離困難問題，以及殘淀粉高導致的蒸餾塔易結垢、飼料顏色深等問題[4]。由于缺少可供選擇的、高效的、商業(yè)化的生料水解酶，以及創(chuàng)新型的生產工藝，導致生料發(fā)酵技術僅在美國的POET 公司的27 個工廠以及歐洲的少數(shù)幾個工廠應用，尚未在更大的范圍內推廣應用。

2 關鍵技術研究

2.1 粉碎預處理技術

由于生料發(fā)酵過程中，原料未經蒸煮，淀粉水解和發(fā)酵的溫度低于淀粉糊化溫度（淀粉顆粒無法膨脹破碎），因此，水解酶與淀粉顆粒的接觸面積很大程度上取決于原料粉碎的顆粒度即粉碎程度。試驗證明[5-6]，顆粒度越細，則越有利于淀粉的水解，進一步有利于提高酒精得率、降低醪液中的殘淀粉含量。但是，粉碎過程是高能耗過程，粉碎越細，能耗越高；同時，粉碎粒度過細，不利于醪液蒸餾后的固液分離，進而影響DDGS 的加工。因此，需要權衡粉碎程度和酒精得率。POET公司普遍將玉米原料粉碎至0.5 mm 篩網(wǎng)通過率100 %。國內試驗優(yōu)化得到的最佳粉碎程度為30～40 目篩通過率100 %[6]。另外，不同類型的粉碎機由于粉碎原理不同，因此對淀粉粒的破壞程度不同，也會影響淀粉的水解效果。愛荷華州立大學的WONGSAGONSUP 等[5]用賽科龍、超級離心和錘片式粉碎機3 種粉碎機分別對玉米進行粉碎，生料發(fā)酵試驗結果表明，由于賽科龍粉碎機能夠破壞玉米更多的淀粉顆粒，而且粉碎粒度更小，因此經過賽科龍粉碎機粉碎的玉米，淀粉水解更充分，乙醇得率更高。

2.2 生淀粉水解技術

2.2.1 生淀粉酶

生淀粉酶一般指可以直接作用、水解或糖化未經蒸煮的淀粉顆粒的酶。因此，生淀粉酶所涉及的酶有α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脫支酶等。

目前，工業(yè)上應用的生淀粉酶主要包括來源于真菌的酸性α-淀粉酶和真菌葡萄糖淀粉酶。真菌α-淀粉酶的來源相對較少，目前工業(yè)上應用的真菌α-淀粉酶幾乎全部來源于絲狀真菌中的曲霉屬微生物，如黑曲霉（Aspergillus niger）和米曲霉（Aspergillus oryzae）等[7]。與細菌α-淀粉酶不同，大多數(shù)真菌α-淀粉酶的作用溫度和pH 值都比較溫和，如最適作用pH 值在5.0～5.5 之間，最適作用溫度為50～55 ℃。真菌α-淀粉酶在現(xiàn)代淀粉糖漿、焙烤制品、啤酒釀制及生料酒精等行業(yè)已得到廣泛的應用[7]。葡萄糖淀粉酶是能從非還原末端外切淀粉的α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵，生成葡萄糖的酶。真菌產生的葡萄糖淀粉酶對生淀粉具有較好的分解作用，不同來源的糖化酶其結構和功能有一定的差異，對生淀粉的水解作用的活力也不同[8]。研究人員通過對分離純化后的葡萄糖淀粉酶的結構解析，進一步闡釋了具有生淀粉糖化酶功效的酶與水解糊化淀粉的糖化酶的不同作用機理，提出了生淀粉糖化酶中特殊的由Cp 區(qū)域和GP-Ⅰ區(qū)域構成的復合體對生淀粉有親合吸附能力[9]。在生料水解過程中，生淀粉酶首先吸附到淀粉顆粒表面，水解產生孔洞結構，通過孔道進入淀粉顆粒內部，從淀粉顆粒內部水解淀粉，同時利用糖化酶的外切活力和淀粉酶的內切活力使淀粉粒表面及內部形成更多水解入口，并水解釋放葡萄糖。生淀粉酶的水解性能是決定生料發(fā)酵技術成敗的最重要因素。如果生淀粉水解能力不足，則發(fā)酵周期長、殘淀粉含量高，酒精得率低；如果添加量大，成本很高，則沒有應用價值。因此，開發(fā)性能高效、成本可控的生淀粉酶（配方）一直是酶制劑公司和生物燃料乙醇企業(yè)研發(fā)的方向。

目前，國際上僅有諾維信、杰能科和帝斯曼等少數(shù)幾家大型酶制劑公司擁有生料淀粉酶的先進生產技術與產品，且一直處于國際領先水平[7]。美國的POET 公司的27 個燃料乙醇工廠使用了諾維信的生淀粉酶Novozyme50009 用于燃料乙醇生料發(fā)酵。由于雙方簽訂了排他協(xié)議，該生淀粉酶未能在其他企業(yè)推廣。杰能科提供了一種用于生料發(fā)酵的專用酶制劑產品，商品名為Stargen。雖然國內使用生淀粉酶Stargen001 的酒精生料發(fā)酵小試結果不錯[10]，但是，由于缺少對涉及該項技術的其他應用環(huán)節(jié)的開發(fā)和掌握，目前國內生物燃料乙醇企業(yè)還沒有使用該生淀粉酶進行酒精生產。國內的山東隆大生物公司也開發(fā)出了真菌α-淀粉酶的商業(yè)化產品，但是也尚未在酒精生產中應用。另外，國內相關科研院校也一直在圍繞開發(fā)新的生淀粉酶開展研究工作[11-13]，希望能獲得新的生物資源，大幅度提高酶活性能。

2.2.2 水解技術

（1）配料濃度

為了減少用水量，節(jié)省能源消耗，同時兼顧糖化和酒精發(fā)酵的效果，通常會將配料濃度控制在干物含量為25 %～45 %，更多地會選擇30 %～35 %的范圍。為了發(fā)酵能快速啟動，也可以選擇采用梯度配料，在發(fā)酵罐裝填前期選用40%的配料濃度，而后期選用30 %的配料濃度，總體配料濃度則維持在35 %。為了抑制細菌的生長，配料時需要將pH 值調至酸性條件，一般維持在pH3～5，實際應用中一般調至pH4.2～4.5[3-4，14]。

（2）溫度調控

酶法水解淀粉顆粒的初始階段為酶與淀粉顆粒相結合，因此，顆粒淀粉水解率與初始形態(tài)、孔隙率、淀粉顆粒的粒徑和表面積有關。α-淀粉酶和糖化酶的顆粒尺寸偏大，分別為幾納米，因為其相對較大的尺寸，這些酶與淀粉顆粒的結合受到限制，從而降低了顆粒淀粉的水解率。為解決該問題，需要盡量使淀粉顆粒膨脹，增加淀粉顆粒的比表面積（每單位質量的干淀粉表面面積）并破壞淀粉顆粒表面。因此，在生淀粉發(fā)酵之前，一般都會有一個較高溫度的預處理水解過程。POET在專利中提到了維持半小時左右的拌料糖化工序，溫度維持在25～40 ℃[4]。史永成[15]提出了一種對生淀粉進行膨脹處理的方法，優(yōu)選溫度在50～55 ℃條件下維持30 分鐘。劉文信等[16]在玉米粉拌料過程中加入蛋白酶和淀粉酶，并調整攪拌速度為90 r/min，然后在60 ℃下維持60 min。房丹[17]研究了兩階段溫度控制對生淀粉酶酶解高濃度玉米淀粉乳的影響，結果表明，與恒溫反應體系相比，利用兩階段溫度控制（第一階段55～65 ℃，第二階段65～70 ℃）明顯提高了生淀粉水解的葡萄糖得率和DE值。

（3）催化因子

國內外學者研究發(fā)現(xiàn)，添加少量的金屬離子對淀粉酶活性有顯著提高，其中以二價金屬離子為主。鈣離子在增加α-淀粉酶酶解效率方面有著雙重的作用，除了能夠促進酶活和維持酶的二級、三級結構的穩(wěn)定性之外[7，18]，還能夠降低淀粉乳的黏度和糊化溫度。房丹[17]研究了鈣離子濃度對生淀粉水解的影響，結果表明，當添加160 mg/L 的鈣離子時，不僅可以顯著提高酶活，而且酶解過程中的黏度明顯下降，葡萄糖得率提高了12 %～16 %。但是，如果鈣離子濃度超過了一定的范圍，反而會對酶的活性產生抑制作用[17-18]。其他金屬離子對酶活力也有影響。韋榮霞等[11]在研究生淀粉糖化酶時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+、Mg2+、Mn2+和Co2+對該酶均有激活作用，其中Fe2+作用明顯；Cu2+和K+對該酶的酶活力有抑制作用。因此，必須準確掌握各種催化因子對酶活力的影響情況，最大限度發(fā)揮酶活性能，避免引起酶水解過程的異常波動。

2.3 發(fā)酵技術

由于酒精生料發(fā)酵周期較長，且原料未經過蒸煮滅菌，發(fā)酵過程容易染菌，因此，主要選用高濃度間歇發(fā)酵技術。該技術的核心要素包括酵母菌、溫度、pH 值、發(fā)酵周期。目前，酒精工業(yè)化生產主要使用的微生物是釀酒酵母，酒精生料發(fā)酵主要也是采用釀酒酵母。POET 研究表明，F(xiàn)ali (Fleischmann's)、Thermosac (Alltech)、Ethanol Red (LeSafre)、BioFerm AFT(North American Bioproducts)等酵母產品均能適應酒精生料發(fā)酵。國內商業(yè)化用于酒精生產的酵母產品有安琪高效釀酒活性干酵母、新疆昇力酒用高活性干酵母等。根據(jù)酵母的特點，發(fā)酵溫度可以控制在26～37 ℃的范圍內，或者在該范圍內采用梯度控溫法[19]，即在發(fā)酵初期將溫度控制在33 ℃左右，高溫下有利于酵母細胞代謝的快速啟動。隨著乙醇濃度的升高，將溫度逐漸降低至20 ℃左右，降低高濃度的乙醇對酵母的傷害，延長酵母壽命。由于細菌的最適pH值為5以上，酵母為3～6，為了有效防止染菌，發(fā)酵的初始pH值可以控制在3～5[20]。通常情況下，為了同步糖化發(fā)酵更加協(xié)調，pH 值一般控制在4.5 左右。由于生料水解過程溫度低，因此水解速率較低、發(fā)酵周期相對較長，在配料濃度在28%～34%的情況下，生料發(fā)酵的周期一般為72～96 h[3，5，16，21]。RASMUSSEN等[3]在研究玉米酒精生料發(fā)酵時，配料濃度為35%（w/w），按醪液量的0.25 %添加干酵母（Fermentis Ethanol Red,Lesaffre Yeast Corp.），初始pH 值為4.5，發(fā)酵溫度27 ℃，在發(fā)酵96 h 后，乙醇濃度達到了147 g/L。趙二永等[14]在研究小麥酒精生料發(fā)酵時，配料濃度為30 %（w/w），按醪液量的0.025 %添加安琪高效釀酒活性干酵母，初始pH 值為4.5，發(fā)酵溫度30 ℃，在發(fā)酵90 h后，乙醇濃度達到了137.8 g/L。

2.4 染菌防治技術

與傳統(tǒng)發(fā)酵相比，酒精發(fā)酵過程中的清潔和衛(wèi)生方面的管理是很不嚴格的，除了生產菌外，還會從原料、空氣、水等帶入一定數(shù)量的雜菌，雜菌感染是影響酒精得率的主要因素。常見雜菌包括乙酸菌、乳酸菌、枯草芽孢菌等，其中乳酸菌是最主要的雜菌，幾乎從所有廠里分離出來的菌群中都有[20]。少量雜菌不會對發(fā)酵過程產生明顯的影響，但如果雜菌大量繁殖，就會給酒精生產帶來嚴重損失[22]。由于酒精生料發(fā)酵周期較長，且原料未經過蒸煮滅菌，因此，相比傳統(tǒng)的酒精發(fā)酵工藝，發(fā)酵過程更容易染菌。因此，能否有效控制生料發(fā)酵過程中雜菌污染是決定該項技術能否實現(xiàn)推廣的關鍵因素之一，這對于保證酒精生產的穩(wěn)定性以及經濟效益至關重要。

2.4.1 抗菌劑

選擇合適的抗菌劑是酒精生產過程中控制雜菌最有效方法和最關鍵的環(huán)節(jié)?？咕鷦┦且种莆⑸锷L的化合物，比如防腐劑，有雙氧水、焦亞硫酸鉀；例如抗生素，有青霉素、莫能菌素、四環(huán)素、鏈霉素和維吉尼亞霉素（見表1）。酒精生產中常采用的抗菌劑有漂白粉、青霉素、安菌泰、克菌靈、酒花等。

表1 乙醇工業(yè)上使用的抗菌劑

漂白粉作為消毒劑已經廣泛應用在自來水中，其在自來水中產生的次氯酸和次氯酸根能夠穿過細菌的細胞壁進入細菌內部，在氯離子的氧化作用下，細菌內的某些酶系受到破壞，導致細菌死亡[23]。筆者曾在拌料過程中添加有效氯含量為0.5～2.0 mg/mL的漂白粉，并維持1～2 h，對控制生料發(fā)酵的染菌水平起到了很好的效果。陳世忠等[24]在發(fā)酵醪中添加漂白粉殺菌，有效控制住了雜菌的數(shù)量，揮發(fā)酸 從0.13～0.15 mg/mL 降 到0.11 mg/mL 以 下。ClO2也是非常好的替代抗生素用于燃料乙醇生產過程中防止和控制染菌的抗菌劑。由于ClO2作為抗菌劑，其作用受玉米乙醇生產過程中的環(huán)境pH值和溫度的影響很小，因此有很明顯的優(yōu)勢。ClO2的使用可以與很多工藝過程相結合并得到很好的控制，比如對用于擴培和發(fā)酵的物料的預處理，對拌料水、回配清液和CIP 清洗液的消毒。ClO2被認為是一種潛在的替代抗生素的安全的抗菌劑，可以用于所有需要控制和防止染菌的工業(yè)發(fā)酵中[20]。

酒精工業(yè)生產主要通過添加抗生素來控制雜菌污染。由于酒精生料發(fā)酵的拌料溫度和水解溫度一般為50～60 ℃，非常適合乳酸菌的生長和繁殖，因此，必須在拌料過程中就添加抗生素。另外，在發(fā)酵前期的醪液、清液和糖漿貯存時，也需要添加適量的抗生素。北美主要使用青霉素G（有時青霉素V）和維吉尼亞霉素來處理燃料乙醇發(fā)酵過程中的染菌。維吉尼亞霉素推薦的添加量是0.25～2 mg/L[25]，低于2 mg/L 時，都不會對酵母乙醇發(fā)酵產生影響，但是當濃度達到20 mg/L 左右時，酵母消耗葡萄糖的速率就會降低[26]。試驗結果表明，添加維吉尼亞霉素的發(fā)酵組（0.5 mg/kg 淀粉漿）比對照組的乙醇得率高11 %[27]。國內主要使用青霉素、安菌泰（商品名）、莫能菌素等來處理燃料乙醇發(fā)酵過程中的染菌。劉勁松[28]研究了生料發(fā)酵中復合抑菌劑的效果，結果表明，青霉素1.5 mg/L、莫能菌素1 mg/L、克茵靈0.5 mg/L、桿菌肽0.5 mg/L 的添加量時，抗菌控制效果最佳。孫振江等[29]研究了青霉素、安菌泰、莫能菌素3 種殺菌劑在木薯酒精發(fā)酵中的殺菌效果，指出3 種殺菌劑均能有效殺菌，最好在發(fā)酵初期添加，但殺菌劑添加量不能超過10 mg/L，否則會對酵母產生抑制作用。

另外，從酒花中提取得的酒花天然抗菌劑Iso tab 產品也已經在歐美的酒精企業(yè)中廣泛應用[30]，是未來替代抗生素的發(fā)展方向之一。酒花中含有的多種有機酸，對酒精發(fā)酵過程中的雜菌都具有良好的抗性，可以消除跨膜pH 值梯度，抑制細菌的生長[31-32]。WONGSAGONSUP 等[5]在生料發(fā)酵前，在醪液中添加2 mg/L 的維吉尼亞霉素和40 mg/L 的酒花提取物。

2.4.2 醪液pH值調控

由于當pH 值低于5.0 時，可以大大降低以乳酸菌為代表的細菌的生長速率，因此，大多數(shù)乙醇生產廠都會通過添加硫酸來調節(jié)醪液pH 值至4.5 以下，實現(xiàn)對細菌感染的控制。有些工廠采用連續(xù)發(fā)酵工藝，甚至將發(fā)酵初始的pH 值調整至4.0 或者更低[20]。然而，較低的pH 值也會降低酵母的代謝活力和糖化酶的活力[33-34]，并導致乙醇得率的下降。如果物料中存在弱酸，如乳酸、乙酸，調低pH值會導致弱酸的非解離態(tài)濃度升高，進而增強了弱酸對酵母生長和乙醇發(fā)酵的抑制作用[20]。

2.4.3 清潔生產措施

酒精生產設備主要以各種罐體和管道為主，制漿水罐、拌料罐、水解罐、發(fā)酵罐、糖漿貯罐等各種罐體和管道的材質以不銹鋼為主，防止菌體的藏匿和滋生，定期用雙氧水、酸堿液等消毒試劑清洗罐體和管道是清潔生產的主要措施[20]。另外，還可以定期對環(huán)境進行消毒，尤其是制漿水罐。制漿水罐是常被忽視，進水和貯水周期等問題在大多數(shù)工廠都沒有嚴格的管理。由于制漿水中存在有機物和細菌，因此在貯存過程中微生物會滋生并產生有機酸。制漿水罐有兩個缺陷，一是設計時沒有帶攪拌，二是溫度低于60 ℃（而不是高于71.1 ℃），使得產乳酸細菌和其他耐高溫的細菌可以存活和生長。由于缺失攪拌，時間一長，底部就會產生沉淀，這些沉淀物可以為雜菌提供保護，甚至在溫度較高的液體中也有保護作用。防止染菌的主要措施是改進對制漿水罐的日常監(jiān)測，通過實驗室測試，掌控潛在的風險。解決此處問題的方法是停機后清除罐內的沉積物，定期添加商業(yè)化殺菌劑可以控制細菌數(shù)量。當然，如果此處的問題反復出現(xiàn)，那么可以通過重新設計裝置來實現(xiàn)將溫度加熱至71.1 ℃左右，達到巴斯消毒法的效果[20]。

2.4.4 其他方案

玉米在采收和儲存過程中都會攜帶各種微生物，尤其是當玉米籽粒出現(xiàn)破損、環(huán)境條件適宜的情況下，微生物還會滋生并產生有毒有害物質。對此，有人研究通過化學法、輻射法、物理篩分法等途徑對儲存過程中和加工前的玉米進行預處理，殺滅微生物、消除有毒有害成分[35]。但是，這種針對玉米籽粒的前處理方式，或者因為處理成本高，或者因為裝備設施無法實現(xiàn)規(guī)模化應用，都尚不具備工業(yè)化推廣應用的條件。

2.5 蒸餾及DDGS顏色控制

由于淀粉生料發(fā)酵結束時，殘淀粉含量較高，蒸餾過程中可能會出現(xiàn)殘淀粉糊化，黏度增加，導致蒸餾塔中殘留物增加；另外，物料顆粒度細，固液分離時，清液中固形物含量高，蒸發(fā)濃縮處理量大；最終還可能導致飼料顏色加深，影響DDGS 的品質。這些問題對酒精生料發(fā)酵技術能否推廣應用同樣起著決定性的作用，一方面關系到能否穩(wěn)定生產，另一方面也會影響飼料的銷售收益。目前，有關這方面的技術研究報道還很少，需要在實際生產和試驗中去摸索和解決。

3 結語

雖然酒精生料發(fā)酵技術的優(yōu)勢非常明顯，但是，由于核心關鍵技術（酶制劑）的脫節(jié)以及系統(tǒng)性應用方案的配套不足，導致該項技術未能在世界范圍內推廣。相反，掌握了核心關鍵技術的美國POET公司旗下的27家燃料乙醇企業(yè)已經全面應用生料發(fā)酵技術，并且為企業(yè)帶來了十分顯著的效益。因此，我們必須勇于創(chuàng)新，迎難而上，系統(tǒng)性地攻克阻礙技術發(fā)展的各個障礙，尤其是要集中各方面的科研力量，開發(fā)適合我國生產特色的酶制劑產品，最終實現(xiàn)該項技術的全面推廣應用，推動我國生物燃料乙醇事業(yè)的發(fā)展。

當前，全球生物燃料乙醇產業(yè)蓬勃發(fā)展，以美國和巴西為代表的世界最大的生物燃料乙醇生產國憑借其國內廉價的原料和先進的生產管理技術生產出低價的產品，不斷威脅著國內生物燃料乙醇生產企業(yè)。創(chuàng)新將成為國內企業(yè)面對挑戰(zhàn)和機遇并存的新時期的唯一制勝法寶。