耐酸酵母菌株的篩選及其在醬香白酒釀造過(guò)程中的應(yīng)用研究

盧 君，山其木格，唐 平，王 麗，孟天毅，梁青松，張 樂(lè)，馮國(guó)躍，李長(zhǎng)文

（1.貴州國(guó)臺(tái)酒業(yè)有限公司，貴州仁懷 564501；2.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院，天津 300410）

醬香型白酒由于其獨(dú)特的釀造工藝和釀造環(huán)境，形成了發(fā)酵過(guò)程中特殊的微生物區(qū)系，而酵母菌群與醬香白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量都有極為密切的關(guān)系[1-2]。參與醬香白酒釀造的酵母菌群種類(lèi)多樣，熊子書(shū)和周恒剛在茅臺(tái)試點(diǎn)實(shí)驗(yàn)時(shí)分離出了卡爾斯伯酵母、粟酒裂殖酵母、釀酒酵母、白地霉、假絲酵母、球擬酵母、畢赤酵母、擲孢酵母等[3-5]。從功能上講，酵母菌群主要起到產(chǎn)酒、產(chǎn)香和產(chǎn)多元醇等作用[6]。

醬香白酒發(fā)酵過(guò)程的糟醅是一種非常復(fù)雜的基質(zhì)，酵母菌的生長(zhǎng)代謝易受到糟醅酸度、水分、糖分、淀粉、代謝副產(chǎn)物、疏松度、含氧量等多方面指標(biāo)的影響。近些年來(lái)，由于茅臺(tái)鎮(zhèn)有時(shí)會(huì)出現(xiàn)極端的天氣情況，導(dǎo)致了個(gè)別年份茅臺(tái)鎮(zhèn)醬酒企業(yè)的普遍減產(chǎn)，損失慘重。這其中主要表現(xiàn)為2 輪次糟醅酸度過(guò)高，3 輪次、4 輪次生產(chǎn)掉排。其中重要的原因是糟醅酸度降至pH≤4.5 后，酵母菌的生理代謝活動(dòng)逐漸受到抑制，對(duì)發(fā)酵原料的轉(zhuǎn)化利用能力及乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)能力也逐漸下降，進(jìn)而導(dǎo)致基酒欠產(chǎn)[7]。因此，篩選具有高耐酸性能的酵母菌株，并強(qiáng)化應(yīng)用于發(fā)酵異常的糟醅中，是解決發(fā)酵力不足，基酒產(chǎn)量低的有效途徑之一。

本研究從醬香白酒發(fā)酵過(guò)程中分離大量酵母菌株，并進(jìn)行分類(lèi)鑒定。挑選代表性的菌株進(jìn)行酸度耐受性篩選實(shí)驗(yàn)，得到高耐酸性酵母，進(jìn)一步驗(yàn)證其發(fā)酵性能。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模液態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)室規(guī)模固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)室規(guī)模糟醅發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證得到可靠結(jié)論后，最終進(jìn)行生產(chǎn)規(guī)模驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并評(píng)價(jià)耐酸酵母菌株應(yīng)用于醬香型白酒釀造過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

菌種來(lái)源：“國(guó)臺(tái)酒-酵母菌種庫(kù)”中從醬香白酒釀造過(guò)程的糟醅和大曲中分離和保藏的酵母屬的菌株共計(jì)90株。

材料：高粱、糟醅，均由酒廠提供。

試劑：磷酸二氫鉀，分析純，津威晨化學(xué)試劑科貿(mào)有限公司；氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈣、三氯化鐵，硫酸錳，分析純，天津威晨化學(xué)試劑科貿(mào)有限公司；蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、胰蛋白胨，生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乳酸，分析純，無(wú)錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司。

培養(yǎng)基：YEPD 培養(yǎng)基，WL 培養(yǎng)基[7]，TTC 培養(yǎng)基[8]，高粱汁培養(yǎng)基[9]：首先，取500 g 粉碎后的高粱，粉碎度90%，添加到2 L 的去離子水中，同時(shí)添加適量的α-淀粉酶溶液；上述混合溶液，經(jīng)過(guò)2 h的蒸煮后，添加適量的糖化酶，接下來(lái)在60 ℃的條件下糖化4 h；取上述經(jīng)過(guò)液化和糖化后的混合液，8000 r/min 離心10 min，上清液即為高粱汁培養(yǎng)液；再加水稀釋調(diào)整糖度至10 Brix，然后分裝，121 ℃滅菌20 min后，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；PCR儀MyCyclerTM Thermal Cycler、凝膠成像系統(tǒng)the Discovery Series 及分析軟件Quantity One 均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；瓊脂糖電泳裝置the Electrophoresis System DYY-6C，購(gòu)自北京六一儀器廠；超純水機(jī)，法國(guó)Millipore 公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，HITACHI U3010；顯微鏡，OLYMPUS BX53F；滅菌鍋，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；分析天平，METTLER；搖床，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；生化培養(yǎng)箱，天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；凈化操作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法和內(nèi)容

本研究總體研究方法流程圖如圖1 所示，以下分步描述方法和內(nèi)容。

圖1 總體研究方法流程圖

1.3.1 酵母菌株的形態(tài)分類(lèi)鑒定

采用WL 培養(yǎng)基進(jìn)行菌落形態(tài)分類(lèi)[7]、采用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分類(lèi)。

1.3.2 酵母菌株分子生物學(xué)分類(lèi)鑒定

采用5.8s-PCR-RFLP 分析以及ITS 測(cè)序的方法進(jìn)行分類(lèi)鑒定[10]。

1.3.3 耐酸酵母菌株的篩選

（1）耐酸實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基的配制：配制YEPD 液體培養(yǎng)基，以乳酸調(diào)酸度至pH2、pH3、pH4、pH5 四個(gè)pH 值梯度。每個(gè)試管分裝10 mL 培養(yǎng)基，每個(gè)樣品做兩個(gè)平行，121 ℃高壓滅菌20 min，備用。

（2）不同酸度下酵母菌株生長(zhǎng)情況觀察：配制YEPD液體培養(yǎng)基，每個(gè)三角瓶分裝25 mL培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌20 min。待滅菌結(jié)束，培養(yǎng)基降溫后，接入酵母菌，28 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)過(guò)夜。次日，用血球計(jì)數(shù)板觀察培養(yǎng)液菌濃度，根據(jù)實(shí)際菌濃度，等量接種于不同酸度培養(yǎng)基中，保證不同酸度培養(yǎng)基中最初菌濃度均為106個(gè)/mL。接菌后，28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)15 h。

（3）分光光度計(jì)測(cè)量：培養(yǎng)液搖勻，取2 mL 菌液，裝入2 mL 離心管，10000 r/min 離心2 min，棄上清液。離心管中加入2 mL 無(wú)菌水，懸浮均勻后，即可進(jìn)行分光光度計(jì)測(cè)量菌濃度。以無(wú)菌水進(jìn)行調(diào)零，測(cè)量600 nm處吸光值。

1.3.4 酵母菌株的發(fā)酵性能測(cè)試

采用TTC 法[8]和杜氏管發(fā)酵法[11]進(jìn)行酵母菌株的發(fā)酵性能測(cè)試。

1.3.5 耐酸酵母菌株的實(shí)驗(yàn)室液態(tài)發(fā)酵性能測(cè)定

將初篩得的菌株接種高粱汁試管于200 r/min、30 ℃培養(yǎng)獲得種子液；取250 mL 三角瓶裝液量150 mL，接種量均為1×106個(gè)/mL。安裝發(fā)酵栓封口膜密封，30 ℃靜置培養(yǎng)，期間稱重，發(fā)酵終點(diǎn)以日減重量少于0.2 g 為準(zhǔn)。發(fā)酵結(jié)束后記錄發(fā)酵時(shí)間，檢測(cè)發(fā)酵液的總酸、還原糖，以及蒸餾液的酒精度、總酸和總酯含量。

1.3.6 耐酸酵母菌株的實(shí)驗(yàn)室固態(tài)發(fā)酵性能測(cè)定

以液化和糖化后的高粱制備固態(tài)培養(yǎng)基，菌種接種量、培養(yǎng)方法同1.3.5。發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)糟醅的酸度、還原糖、淀粉含量；以及蒸餾液的酒精度、總酸和總酯含量。

1.3.7 耐酸酵母菌株的實(shí)驗(yàn)室糟醅發(fā)酵性能測(cè)定

取酒廠釀酒生產(chǎn)時(shí)的糟醅作為培養(yǎng)基，菌種接種量、培養(yǎng)方法同1.3.5。發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)糟醅的水分、酸度、還原糖、淀粉含量；以及蒸餾液的酒精度、總酸和總酯含量。

1.3.8 耐酸酵母菌株的生產(chǎn)規(guī)模驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

選擇耐酸、產(chǎn)酒功能明確的酵母菌株，制作成液體培養(yǎng)液，應(yīng)用于貴州國(guó)臺(tái)酒業(yè)有限公司4 輪次生產(chǎn)時(shí)4 個(gè)不同班組的堆積和窖池發(fā)酵過(guò)程中。跟蹤實(shí)驗(yàn)窖池出窖糟醅的理化指標(biāo)，并且評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)窖池基酒產(chǎn)質(zhì)量情況。

1.3.9 測(cè)定分析方法

酸度測(cè)定采用酸堿滴定法、糖分和淀粉含量采用斐林滴定法，具體檢測(cè)方法參見(jiàn)《白酒生產(chǎn)技術(shù)全書(shū)》[12]。

蒸餾液酒精度、總酯、總酸：參照GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株分類(lèi)鑒定結(jié)果

本研究利用形態(tài)學(xué)分類(lèi)和分子生物學(xué)分類(lèi)的方法，針對(duì)從貴州國(guó)臺(tái)酒業(yè)有限公司釀造過(guò)程的糟醅和大曲中分離得到的90 株酵母屬的菌株，分類(lèi)鑒定為7 個(gè)不同的種，在鑒定結(jié)果的基礎(chǔ)上，每種分類(lèi)結(jié)果對(duì)應(yīng)的酵母菌株隨機(jī)挑選6 株，共計(jì)42株，用于后續(xù)的耐酸酵母菌篩選實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 酵母菌株耐酸性能篩選

以42 株酵母菌株為出發(fā)菌株，活化培養(yǎng)后分別接種于不同酸度的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)結(jié)束后根據(jù)菌體濃度來(lái)評(píng)價(jià)酵母菌株的耐酸性能。結(jié)果顯示粟酒裂殖酵母和釀酒酵母的耐酸性能要高于其他種的酵母，同時(shí)還觀察到這兩種酵母也是糟醅出窖時(shí)的優(yōu)勢(shì)菌株。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)室篩選的耐酸性能結(jié)果與釀酒環(huán)境自然篩選的結(jié)果是一致的。本研究將42株酵母菌株的耐酸性能進(jìn)行排序，位列前4 位的酵母菌株編號(hào)分別為：LJ3、LJ5、NJ2、LJ4。這4 株耐酸菌株在pH2、pH3、pH4、pH5梯度的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖2。

2.3 酵母菌株發(fā)酵性能初步篩選

利用TTC 平板法和杜氏管法，對(duì)42 株酵母菌株進(jìn)行發(fā)酵性能的初步篩選。根據(jù)菌落顏色（紅色）的深淺和產(chǎn)氣的效果，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母NJ2 的發(fā)酵性能處于前3 位；粟酒裂殖酵母LJ3、LJ5、LJ4 發(fā)酵速率較慢，但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，也表現(xiàn)出較強(qiáng)的發(fā)酵性能?？紤]到耐酸性能是實(shí)驗(yàn)最關(guān)心的，所以確定這4株酵母作為后續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的菌株。

表1 酵母菌的菌落菌體形態(tài)和RFLP分析鑒定表

圖2 酵母菌株耐酸性能篩選結(jié)果

2.4 實(shí)驗(yàn)室液態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

將篩選出的4 株耐酸酵母菌株LJ3、LJ5、NJ2、LJ4 活化后，分別接種于高粱汁培養(yǎng)基中，于30 ℃靜置培養(yǎng)，每隔24 h振蕩稱重，記錄失重量，發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)氣情況見(jiàn)圖3。發(fā)酵結(jié)束后，檢測(cè)發(fā)酵液和蒸餾液的理化指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表2。

由圖3 能夠看出，釀酒酵母NJ2 的發(fā)酵速率明顯高于粟酒裂殖酵母LJ3、LJ5、LJ4。兩種酵母表現(xiàn)出了不同的發(fā)酵性能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，這兩種酵母對(duì)于醬香白酒發(fā)酵都是不可或缺的，既需要發(fā)酵速率快的酵母，也需要符合“前緩、中挺、后緩落”規(guī)律的酵母菌株，共同參與醬香白酒釀造過(guò)程中。

圖3 實(shí)驗(yàn)室液態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)產(chǎn)氣結(jié)果

由表2看出，釀酒酵母NJ2發(fā)酵時(shí)間更短，而粟酒裂殖酵母LJ3、LJ5、LJ4，雖然發(fā)酵時(shí)間更長(zhǎng)，但是卻表現(xiàn)出了更高的產(chǎn)酒能力。

2.5 實(shí)驗(yàn)室固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

將篩選出的4 株耐酸酵母菌株LJ3、LJ5、NJ2、LJ4 活化后，分別接種于高粱培養(yǎng)基中，于30 ℃下靜置培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，檢測(cè)發(fā)酵后高粱和蒸餾液的理化指標(biāo)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 耐酸酵母液態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)性能指標(biāo)

表3 耐酸酵母固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)性能指標(biāo)

由表3 看出，固態(tài)發(fā)酵時(shí)，所有酵母表現(xiàn)出比較相似的發(fā)酵能力，其中粟酒裂殖酵母LJ3 的產(chǎn)酒能力更強(qiáng)。

2.6 實(shí)驗(yàn)室糟醅發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

將篩選出的4 株耐酸酵母菌株LJ3、LJ5、NJ2、LJ4 活化后，分別接種于酒廠實(shí)際生產(chǎn)時(shí)4 輪次的入窖糟醅樣品中，于30 ℃下靜置培養(yǎng)，每隔24 h 振蕩稱重，記錄失重量，發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)氣情況見(jiàn)圖4。發(fā)酵結(jié)束后，檢測(cè)糟醅和蒸餾液的理化指標(biāo)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 耐酸酵母糟醅發(fā)酵實(shí)驗(yàn)性能指標(biāo)

由圖4 可以看出，利用釀酒過(guò)程的糟醅作為培養(yǎng)基，驗(yàn)證4 種耐酸酵母菌時(shí)，發(fā)酵速率差異并不大。發(fā)酵過(guò)程添加了酵母菌株后，相比于原始糟醅，發(fā)酵速率都有明顯增加。并且，粟酒裂殖酵母的最高產(chǎn)氣量要高于釀酒酵母。

從表4 能夠看出，利用釀酒過(guò)程的糟醅作為培養(yǎng)基，添加酵母后，蒸餾液的酒精度均有明顯提升，總酯的含量小幅提升，其他理化指標(biāo)差別不大。

圖4 實(shí)驗(yàn)室糟醅發(fā)酵實(shí)驗(yàn)產(chǎn)氣結(jié)果

2.7 耐酸酵母菌劑生產(chǎn)應(yīng)用發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)室液態(tài)、固態(tài)、糟醅發(fā)酵實(shí)驗(yàn)積累的驗(yàn)證結(jié)果，我們最終選擇應(yīng)用釀酒酵母NJ2 和粟酒裂殖酵母LJ3 作為強(qiáng)化菌株，兩種酵母培養(yǎng)液按1∶1 比例混合作為耐酸酵母菌劑，從4 個(gè)不同班組各選擇1 個(gè)窖池作為實(shí)驗(yàn)窖池（該班組其余正常生產(chǎn)的窖池作為對(duì)照窖），分別投入4 輪次生產(chǎn)過(guò)程的糟醅堆積階段和入窖階段。跟蹤發(fā)酵的進(jìn)程，發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)出窖糟醅的理化指標(biāo)，見(jiàn)表5，基酒的產(chǎn)量變化見(jiàn)表6。

表5 耐酸酵母菌劑生產(chǎn)應(yīng)用發(fā)酵實(shí)驗(yàn)理化指標(biāo)

表6 耐酸酵母菌劑生產(chǎn)應(yīng)用試驗(yàn)基酒的產(chǎn)量變化

由表5、表6 可看出，在強(qiáng)化了耐酸酵母菌劑之后，出窖糟醅的各項(xiàng)理化指標(biāo)未見(jiàn)明顯變化。而基酒產(chǎn)量卻有明顯的提高，提高比率在13.47 %～25.97%之間，說(shuō)明在糟醅發(fā)酵力不足時(shí)，提高耐酸酵母的生物量對(duì)于提升基酒的產(chǎn)量有直接的聯(lián)系。對(duì)于質(zhì)量的評(píng)價(jià)，使用耐酸酵母菌劑后實(shí)驗(yàn)班組的基酒均符合輪次基酒風(fēng)格特征的要求，除口感略偏甜外，其他風(fēng)味指標(biāo)沒(méi)有明顯差異。

3 結(jié)論

本研究從醬香白酒發(fā)酵過(guò)程中篩選得到4 株耐酸性能良好的酵母菌株，鑒定結(jié)果顯示為1 株釀酒酵母和3 株粟酒裂殖酵母。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室液態(tài)、固態(tài)、糟醅發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了這4 株酵母菌的發(fā)酵性能，優(yōu)選出釀酒酵母NJ2 和粟酒裂殖酵母LJ3 作為強(qiáng)化菌株，應(yīng)用于生產(chǎn)的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在強(qiáng)化了耐酸酵母菌劑之后，出窖糟醅的各項(xiàng)理化指標(biāo)未見(jiàn)明顯變化。而基酒產(chǎn)量卻有明顯的提高，提高比率在13.47%～25.97%之間，基酒質(zhì)量除口感略偏甜外，其他風(fēng)味指標(biāo)沒(méi)有明顯差異。本研究篩選到的耐酸酵母菌株和采用的技術(shù)，可有效應(yīng)對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)有時(shí)會(huì)出現(xiàn)極端天氣導(dǎo)致的2 輪次糟醅酸度過(guò)高，發(fā)酵力不足，3 輪次、4 輪次生產(chǎn)掉排現(xiàn)象。作為一種儲(chǔ)備的應(yīng)急技術(shù)，對(duì)于企業(yè)來(lái)說(shuō)具有實(shí)際的應(yīng)用意義。