唐聞瓊 邢凱慧 吳世麗 蘇麗娜

反復(fù)喘息屬于呼吸道疾病之一，嬰幼兒反復(fù)喘息發(fā)生率較高，同時(shí)反復(fù)喘息還可增加呼吸道高反應(yīng)性及哮喘的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[1]。研究顯示，采用肺功能檢測(cè)診斷反復(fù)喘息嬰幼兒具有重要參考價(jià)值，其中潮氣呼吸肺功能檢測(cè)指標(biāo)均對(duì)反復(fù)喘息嬰幼兒具有較高診斷價(jià)值[2]。由于反復(fù)喘息嚴(yán)重影響患兒生長(zhǎng)發(fā)育及身心健康發(fā)展，因而分析喘息相關(guān)影響因素及其可能機(jī)制對(duì)降低嬰幼兒哮喘發(fā)生及提高治療效果均具有重要意義。研究表明，輔助性T淋巴細(xì)胞1(T helper cell 1，Th1)與輔助性T淋巴細(xì)胞2(T helper cell 2，Th2)比例失衡?？蓞⑴c哮喘發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[3]。研究顯示，γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)與白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)是Th1細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，而白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)是Th2細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，IFN-γ/IL-4比值可反應(yīng)Th1/Th2比值狀態(tài)[4]。輔助性T淋巴細(xì)胞(T helper cell，Th)定向分化取決于其轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，相關(guān)研究表明T-bet(T-box expressed in T cells)可控制Th細(xì)胞分化為Th1，而GATA結(jié)合蛋白3(GATA-binding protein-3，GATA-3)可控制Th細(xì)胞分化為Th2[5]。關(guān)于反復(fù)喘息嬰幼兒的T-bet/GATA-3比值與Th1/Th2平衡的相關(guān)性研究相對(duì)較少，因此，本研究主要探討T-bet/GATA-3比值與反復(fù)喘息嬰幼兒潮氣呼吸肺功能及其與Th1/Th2平衡的關(guān)系，旨在為臨床診斷及治療提供參考依據(jù)。

資料與方法

1.一般資料：選取2017年12月至2018年5月本院收治的反復(fù)喘息嬰幼兒86例為反復(fù)喘息組，判斷標(biāo)準(zhǔn)均參照相關(guān)文獻(xiàn)[6]，其中男52例，女34例，年齡為6～36個(gè)月，平均年齡為(23.6±6.2)個(gè)月。根據(jù)反復(fù)喘息嬰幼兒肺功能分度[7]將其分為輕度阻塞組(30例)、中度阻塞組(42例)、重度阻塞組(14例)。同時(shí)選取同期在本院兒保門診體檢的健康兒童72例為對(duì)照組，其中男37例，女35例，年齡為10～36個(gè)月，平均為(22.1±6.4)個(gè)月。兩組兒童性別、年齡、營(yíng)養(yǎng)狀況等臨床資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有嬰幼兒家長(zhǎng)均知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)包括(1)反復(fù)喘息嬰幼兒表現(xiàn)為反復(fù)咳嗽且肺部有鳴音；(2)未曾服用免疫抑制劑及免疫調(diào)節(jié)劑。排除標(biāo)準(zhǔn)包括(1)患有先天性心臟??；(2)支氣管及肺發(fā)育不良患兒；(3)支氣管異物等其他原因引起的喘息；(4)先天性氣道發(fā)育畸形引起的喘息。

2.樣本采集與分離：分別抽取兩組受試幼兒外周靜脈血5 ml，置于EDTA抗凝試管內(nèi)，加入磷酸鹽緩沖液稀釋，參照相關(guān)文獻(xiàn)提取單個(gè)核細(xì)胞[8]，并將其置于含有雙抗(1%)與含有胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中待用。

3.實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)T-bet、GATA-3 mRNA表達(dá)水平：取單核細(xì)胞(1×106)并采用TRNzol Universal總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)(北京京科瑞達(dá)科技有限公司)檢測(cè)RNA純度及濃度。根據(jù)QuantScript RT Kit試劑盒(北京天根生化科技有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。T-bet上游引物序列為5′-TGGTCCAAGTTTAATCAGCACCAG-3′，下游引物序列為5′-CCCGGCCACAGTAAATGACAGG-3′；GATA-3上游引物序列為5′-CCTCATTAA GCCCAAGCGAAG-3′，下游引物序列為5′-TCCAGAGTGTGGTTGTGGTG-3′；β-actin正向引物序列為5′-CAGCCATGTACGTTGCTATCCAGG-3′，反向引物序列為5′-AGGTCCAG ACGCAGGATGGCATG-3′，引物均由北京博爾邁生物技術(shù)公司。按照SYBR? Green JumpStart Taq ReadyMix 試劑盒(美國(guó)Sigma公司)說(shuō)明書進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。置于LightCycler96熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，程序設(shè)定為95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算T-bet、GATA-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th1/Th2細(xì)胞百分率：分別取單核細(xì)胞(1×106)置于細(xì)胞培養(yǎng)液(1ml)內(nèi)，加入PMA、Ionomycin溶液(終濃度分別為0.1 mg/ml、1mg/ml)及2 μl Golgistop溶液，其中PMA與Ionomycin均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Golgistop購(gòu)自美國(guó)BD公司。置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h，收集細(xì)胞并采用磷酸鹽緩沖液清洗，取3個(gè)流式管分別加入CD3-eFluor(5 μl)、CD8a-FITC抗體(5 μl)，室溫孵育30 min，磷酸鹽緩沖液清洗后加入200 μl破膜劑(美國(guó)BD公司)，同時(shí)分別向2個(gè)流式管內(nèi)加入IFN-γ-PE(5 μl)、抗IL-4-PE(5 μl)，對(duì)照管內(nèi)加入同型對(duì)照抗體，室溫孵育30 min，清洗后加150 μl多聚甲醛固定液重懸細(xì)胞，置于BD FACS CantoTMⅡ型流式細(xì)胞儀(北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司)進(jìn)行檢測(cè)，Th1細(xì)胞中檢測(cè)IFN-γ表達(dá)情況，Th2細(xì)胞中檢測(cè)IL-4表達(dá)情況。

5.檢測(cè)Th1/Th2細(xì)胞因子水平：取兩組兒童靜脈血4 ml，經(jīng)3 500 r/min轉(zhuǎn)速離心機(jī)離心5 min分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清IFN-γ、IL-4、IL-10水平，檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Ebioscience公司，Synergy NEO2 HTS全功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器有限公司。

6.潮氣呼吸肺功能檢測(cè)：采用Master Screen Paed型兒童肺功能儀(德國(guó)耶格公司)檢測(cè)兩組受試兒童潮氣呼吸肺功能，需先清理患兒鼻咽與呼吸道分泌物，待兩組受試兒童熟睡后取仰臥位，擇取適合面罩置于口鼻，潮氣呼吸肺功能主要參數(shù)包括每千克體重潮氣量(tidal volume per kilogram of body weight，VT/kg)、吸呼比(inhalation time / expiration time，Ti/Te)、達(dá)峰時(shí)間比(time to peak expiratory flow / time to expiratory，TPTEF/TE)、達(dá)峰容積比(volume to peak expiratory flow / volume to expiratory，VPEF/VE)、呼吸頻率(respiratory rate，RR)、潮氣呼吸呼氣峰流速(peak tidal expiratory flow rate，PTEF)。根據(jù)TPTEF/TE與VPEF/VE比值范圍將反復(fù)喘息嬰幼兒分為肺功能輕度阻塞組、中度阻塞組與重度阻塞組，分析反復(fù)喘息嬰幼兒不同肺功能組T-bet/GATA-3比值變化。

結(jié)果

1.兩組研究對(duì)象T-bet/GATA-3比值比較：反復(fù)喘息組患兒T-bet mRNA表達(dá)水平與T-bet/GATA-3比值均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而GATA-3 mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.兩組兒童潮氣呼吸肺功能參數(shù)比較：反復(fù)喘息組患兒VT、Ti/Te、TPTEF/TE、VPEF/VE均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而RR、PTEF均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

3.反復(fù)喘息嬰幼兒T-bet/GATA-3比值與潮氣呼吸肺功能的關(guān)系：結(jié)果顯示，重度阻塞組與中度阻塞組T-bet mRNA表達(dá)水平與T-bet/GATA-3比值均顯著低于輕度阻塞組(P<0.05)，且重度阻塞組顯著低于中度阻塞組(P<0.05)；而GATA-3 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，且重度阻塞組顯著高于中度阻塞組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

采用Pearson法進(jìn)一步分析反復(fù)喘息嬰幼兒T-bet/GATA-3比值與潮氣呼吸肺功能參數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，T-bet/GATA-3比值與VT、Ti/Te呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，而與RR呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，但與PTEF無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表2 兩組兒童潮氣呼吸肺功能參數(shù)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

表3 反復(fù)喘息嬰幼兒不同肺功能分度與T-bet/GATA-3比值的關(guān)系

注：與輕度阻塞組比較，*P<0.05；與中度阻塞組比較，#P<0.05

表4 反復(fù)喘息嬰幼兒T-bet/GATA-3比值與潮氣呼吸肺功能參數(shù)的相關(guān)性分析

4.兩組受試兒童Th1/Th2細(xì)胞百分率及其細(xì)胞因子比較：反復(fù)喘息組患兒Th1與Th1/Th2細(xì)胞百分率均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而Th2細(xì)胞百分率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表5。

研究患兒血清IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而血清IL-4、IL-10水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表6。

5.反復(fù)喘息嬰幼兒T-bet/GATA-3比值與Th1/Th2平衡的關(guān)系：采用Pearson法分析反復(fù)喘息嬰幼兒T-bet/GATA-3比值與Th1/Th2細(xì)胞比值的相關(guān)性，結(jié)果顯示，T-bet/GATA-3比值與Th1/Th2呈正相關(guān)(r=0.307，P=0.004)，見(jiàn)圖1。

表5 兩組受試兒童Th1/Th2細(xì)胞百分率比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

表6 兩組兒童Th1/Th2細(xì)胞因子比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖1 反復(fù)喘息嬰幼兒T-bet/GATA-3比值與Th1/Th2的相關(guān)性分析

討論

喘息是嬰幼兒常見(jiàn)呼吸系統(tǒng)疾病之一，而反復(fù)喘息可導(dǎo)致哮喘的發(fā)生，其主要病理特征為氣流受限與氣道高反應(yīng)性，嬰幼兒反復(fù)喘息與哮喘的診斷及治療是研究難題[9]。肺功能檢測(cè)可作為反復(fù)喘息及哮喘的輔助診斷，也可作為評(píng)估疾病嚴(yán)重程度及治療效果的依據(jù)[10]。因此，探究嬰幼兒反復(fù)喘息的可能發(fā)病機(jī)理并及時(shí)采取干預(yù)措施對(duì)提高治療效果及改善患兒預(yù)后均具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄因子T-bet在哮喘患者肺組織中呈低表達(dá)并減少IFN-γ分泌，而轉(zhuǎn)錄因子GATA-3在哮喘患者肺泡灌洗液及支氣管粘膜活檢組織中呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與患者氣道高反應(yīng)性呈正相關(guān)，而與氣道口徑呈負(fù)相關(guān)[11-12]。研究表明，哮喘兒童外周血單核細(xì)胞中T-bet表達(dá)水平低于正常兒童，而GATA-3表達(dá)水平高于正常兒童，T-bet/GATA-3比值失衡與兒童哮喘發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[13]。關(guān)于反復(fù)喘息嬰幼兒中T-bet/GATA-3比值表達(dá)變化的研究相對(duì)較少，本研究結(jié)果顯示，反復(fù)喘息嬰幼兒外周血單核細(xì)胞中T-bet表達(dá)水平與T-bet/GATA-3比值均低于正常兒童，而GATA-3表達(dá)水平明顯升高，說(shuō)明T-bet與GATA-3均參與嬰幼兒反復(fù)喘息過(guò)程，T-bet/GATA-3比值降低可能導(dǎo)致嬰幼兒反復(fù)喘息的發(fā)生。提示嬰幼兒外周血單核細(xì)胞中T-bet/GATA-3失衡可作為判斷嬰幼兒反復(fù)喘息發(fā)生的重要輔助指標(biāo)。潮氣呼吸肺功能檢測(cè)是用于評(píng)估嬰幼兒肺功能的技術(shù)，研究顯示，TPTEF/TE與VPEF/VE是潮氣呼吸肺功能檢測(cè)的重要參數(shù)，并可用于評(píng)估患兒小氣道阻塞情況，其數(shù)值越低提示小氣道阻塞越嚴(yán)重[14]。本研究結(jié)果顯示，反復(fù)喘息患兒VT、Ti/Te、TPTEF/TE、VPEF/VE均低于對(duì)照組，而RR、PTEF均明顯升高，VT降低與RR升高可能是由于氣道炎性反應(yīng)發(fā)生增加分泌物生成量并引起下呼吸道阻塞導(dǎo)致肺部通氣及換氣功能障礙，Ti/Te降低說(shuō)明反復(fù)喘息患兒氣道阻塞時(shí)呼氣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，TPTEF/TE與VPEF/VE降低說(shuō)明反復(fù)喘息患兒存在阻塞性通氣功能障礙且與阻塞嚴(yán)重程度有關(guān)，PTEF升高說(shuō)明反復(fù)喘息患兒大氣道阻力增強(qiáng)。進(jìn)一步分析T-bet/GATA-3比值與反復(fù)喘息患兒潮氣呼吸肺功能的關(guān)系，本研究根據(jù)患兒肺功能將其分為輕度阻塞組、中度阻塞組與重度阻塞組，結(jié)果顯示，重度阻塞組與中度阻塞組T-bet表達(dá)水平與T-bet/GATA-3比值均低于輕度阻塞組，且重度阻塞組低于中度阻塞組；而GATA-3表達(dá)水平升高，且重度阻塞組高于中度阻塞組，說(shuō)明隨著反復(fù)喘息患兒肺功能減弱T-bet/GATA-3比值明顯降低。相關(guān)性分析顯示，T-bet/GATA-3比值與VT、Ti/Te呈正相關(guān)，而與RR呈負(fù)相關(guān)，提示T-bet/GATA-3比值與反復(fù)喘息患兒潮氣呼吸肺功能密切相關(guān)。

T-bet可促進(jìn)Th細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，并激活I(lǐng)FN-γ基因表達(dá)進(jìn)而提高其表達(dá)水平，同時(shí)抑制Th2細(xì)胞生成并可將其轉(zhuǎn)化為Th1細(xì)胞[15]。GATA-3可促進(jìn)Th細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Th2細(xì)胞并促使Th2細(xì)胞因子IL-4生成，同時(shí)可抑制Th1細(xì)胞生成并促進(jìn)Th2細(xì)胞生成，研究顯示，哮喘患兒T-bet/GATA-3比值可作為衡量Th1/Th2細(xì)胞平衡的重要指標(biāo)[16]。Th1細(xì)胞的主要細(xì)胞因子IFN-γ可激活巨噬細(xì)胞并促使其分泌細(xì)胞因子進(jìn)而發(fā)揮抗炎、抗感染免疫等作用，研究表明Th2細(xì)胞分泌的IL-4可促使IFN-γ分泌減少并刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子進(jìn)而促進(jìn)哮喘等炎癥性疾病發(fā)生[17]。關(guān)于Th1/Th2失衡與反復(fù)喘息嬰幼兒之間關(guān)系的研究相對(duì)較少，本研究結(jié)果顯示，反復(fù)喘息患兒Th1、Th1/Th2細(xì)胞百分率、血清IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值均顯著低于對(duì)照組，而Th2細(xì)胞百分率、血清IL-4、IL-10水平均顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明Th1/Th2失衡可促進(jìn)炎性因子IL-4、IL-10釋放進(jìn)而加重患兒體內(nèi)炎癥反應(yīng)，提示Th1/Th2失衡與嬰幼兒反復(fù)喘息發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)T-bet/GATA-3比值與Th1/Th2細(xì)胞百分率呈正相關(guān)，提示T-bet/GATA-3比值降低促進(jìn)Th1/Th2失衡進(jìn)而導(dǎo)致反復(fù)喘息嬰幼兒免疫失衡。

綜上所述，反復(fù)喘息嬰幼兒外周血單核細(xì)胞中T-bet/GATA-3比值降低，并與患兒潮氣呼吸肺功能有關(guān)，同時(shí)還可導(dǎo)致患兒免疫失衡，有效逆轉(zhuǎn)T-bet/GATA-3比值可能作為反復(fù)喘息嬰幼兒的治療切入點(diǎn)。本研究存在一定不足，關(guān)于T-bet與GATA-3在嬰幼兒反復(fù)喘息發(fā)生及發(fā)展過(guò)程的具體作用機(jī)制有待深入研究。