呂晶 馬玲 張銘 史蕾 覃菊玲 洪志丹

男性不育癥是夫妻不孕不育的重要因素之一。國內(nèi)有研究顯示，約有15%的育齡期夫婦患有不育癥或曾面臨不育問題，其中男方因素約占50%[1]。目前，精液常規(guī)分析作為臨床上最常用的評估男性生育能力的指標，在需篩選優(yōu)質(zhì)精子的輔助生殖技術(shù)等領(lǐng)域存在一定的局限性，已不能滿足臨床要求[2-3]。作為傳統(tǒng)常規(guī)精液檢查的重要補充，精子DNA碎片率(DNA fragmentation index，DFI)檢測為判斷精子質(zhì)量的優(yōu)劣提供了一個新的參考方法[4]。隨著對精子DNA損傷研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)精子DFI能更好地評估男性生育力，同時在預(yù)測輔助生殖技術(shù)助孕結(jié)局上具有尤為重要的作用[5]。因此，檢測精子DFI對不育患者精子質(zhì)量的評估具有極大的價值。本文旨在分析精子 DNA碎片率與患者年齡、精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)性，研究精子DNA損傷在評估男性生育能力中的應(yīng)用價值。

資料與方法

1.一般資料：選擇2015年6月—2018年12月在武漢大學中南醫(yī)院生殖醫(yī)學中心就診的2 963名男性作為研究對象。納入標準包括(1)武漢市常駐人口；(2)年齡18歲及以上；(3)精子濃度≥5×106/ml；(4)取精過程無遺漏；(5)男性生殖系統(tǒng)體格檢查(包括第二性征、陰莖、陰囊、精索、輸精管、附睪、睪丸等)均無異常者等。

2.標本收集：患者禁欲2～7 d，手淫法收集新鮮精液于潔凈廣口取精杯內(nèi)，立即放置于35℃溫箱中液化后將標本分成兩份，一份行常規(guī)精液分析，一份行精子DFI檢測。

3.精子DNA碎片率檢測：采用精子染色質(zhì)擴散法(sperm chromatin dispersion,SCD)檢測精子DFI，使用安徽安科生物科技有限公司的精子DNA碎片染色試劑盒(產(chǎn)品備案號：皖合械備20160005)。嚴格按照說明書進行操作，在普通光學顯微鏡下觀察計數(shù)200條以上精子，計數(shù)存在DNA碎片的精子的數(shù)量。判斷標準為精子頭部僅產(chǎn)生較小的光暈或無光暈，或單側(cè)光暈的厚度不超過精子頭部最小直徑的1/3，均被判斷為存在DNA碎片的精子。精子DFI=存在DNA碎片的精子個數(shù)/計數(shù)總精子個數(shù)×100%。

4.精液分析：根據(jù)《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》第五版標準[6]，通過應(yīng)用計算機輔助精液分析系統(tǒng)(CASA)分析精子常規(guī)參數(shù)。將10 μl已經(jīng)完全液化的精液加至以色列產(chǎn)精子計數(shù)板(Makler counting chamber，sefi-medical instruments)配合CASA進行分析，得到精子濃度、總活力、前向運動精子百分率等并記錄。

5.統(tǒng)計學處理：應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料采用均數(shù)±標準差表示；變量間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。多因素間的相關(guān)性分析采用多元線性回歸分析，以R2>0.25為大效應(yīng)，顯著性值P<0.001表明有極顯著的統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1.精子DFI與患者年齡、精液常規(guī)參數(shù)一般情況：2 963例患者的年齡、精液常規(guī)參數(shù)及精子DFI均符合正態(tài)分布?；颊吣挲g平均為(33.9±6.3)歲，禁欲時間為(3.9±1.3)d，精液液化時間為(28.0±8.3)min，精液量為(3.4±1.5)ml，精子濃度為(62.2±43.7)×106/ml，精子總數(shù)為(198.9±156.4)×106精子/每次射精，精子總活力為(47.2±17.5)%，精子正常形態(tài)率為(6.1±2.4)%，精子DFI為(12.5±7.5)%。

2.精子DFI與患者年齡、精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)分析結(jié)果：Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，精子DFI與患者年齡(r=0.254,P<0.01)、禁欲時間(r=0.181,P<0.01)、液化時間(r=0.094,P<0.01)、精液量(r=0.062,P<0.01)、精子總數(shù)(r=0.056,P<0.01)均呈正相關(guān)，精子DFI與精子總活力呈負相關(guān)(r=-0.505，P<0.01)，精子DFI與精子正常形態(tài)率呈負相關(guān)(r=-0.212，P<0.01)；精子濃度與精子DFI不存在相關(guān)性(P>0.01)。

3.多元線性回歸分析結(jié)果：構(gòu)建模型后得到R2=0.325、調(diào)整R2=0.324、Durbin-Watson=1.856，R2>0.25表明為大效應(yīng)，模型擬合優(yōu)度較高，同時DW值接近2，認定殘差獨立通過檢驗。進一步采用F檢驗方法對回歸方程進行顯著性檢驗,得到結(jié)果F=356.272，P<0.001，表明回歸方程有極顯著的統(tǒng)計學意義。表1數(shù)據(jù)顯示，患者年齡、精子總數(shù)、活力、正常形態(tài)率與精子DFI之間的線性伴隨變化有極顯著的統(tǒng)計學意義(t年齡=10.377，P<0.001，t精子總數(shù)=12.839，P<0.001，t精子總活力=-30.480，P<0.001，t精子正常形態(tài)率=-4.087，P<0.001)?；貧w方程為精子DFI=15.827+0.189×年齡+0.01×精子總數(shù)-0.22×精子總活力-0.208×精子正常形態(tài)率，說明當患者年齡增長1歲，精子DFI值會增長0.189%；當精子總數(shù)增長1×106，精子DFI值會增長0.010%；當精子總活力增長1%，精子DFI值會降低0.220%；當精子正常形態(tài)率增長1%，精子DFI值會降低0.208%?；貧w分析顯示標準化殘差左右兩側(cè)對稱，P-P圖中散點均靠近斜線，回歸殘差滿足正態(tài)性。

討論

人類精子DNA損傷是一種常見的男性生殖能力下降的原因[7]。在各種內(nèi)外環(huán)境及遺傳因素的影響下，如年齡、生活作息、吸煙、環(huán)境污染、某些疾病感染等，均會導致精子DNA不同程度的損傷[8]。目前認為，導致精子DNA損傷主要有3個原因，即精子染色質(zhì)組裝異常，精子細胞的異常凋亡及氧化應(yīng)激反應(yīng)[9-10]。而染色質(zhì)組裝異常是其損傷的主要原因[7]。為確保DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，精子在成熟過程中大量巰基被氧化成二硫鍵，使得DNA結(jié)合更緊密，但當其被多種有害的因素影響時，發(fā)育異常的精子中巰基未被氧化成二硫鍵，DNA由雙鏈斷裂，或變形為單鏈，這樣就形成精子DNA碎片[11]。常用于檢測精子 DNA 完整性的方法有精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析(sperm chromatin structure assay，SCSA)、彗星實驗(comet assay)、末端轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP末端標記法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)和SCD法[12]等。相較而言，SCD法具有操作簡便、快捷、準確、經(jīng)濟、重復(fù)性較好等優(yōu)點[13]，自2003年Fernandez等[14]發(fā)明以來已被廣泛應(yīng)用于精子 DNA 完整性的研究。本研究采用SCD法檢測精子DNA完整性，結(jié)果可靠。

表1 精液常規(guī)參數(shù)在方程中的回歸系數(shù)結(jié)果

學者們對男性不育患者的年齡與其精子DFI相關(guān)性的研究比較多。本研究顯示，隨著男性年齡的增加，精液中精子DFI顯著升高，與大多數(shù)學者的研究結(jié)果一致[15-17]。究其原因，現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)表明，隨著男性年齡增長，睪丸、前列腺和附睪等器官逐漸老化，導致活性氧自由基( reactive oxygen species，ROS) 增多及其抗氧化能力下降[18]。ROS生成量超過了精子抗氧化的防御能力的極限，那么就會導致機體內(nèi)活性氧積聚，誘導氧化應(yīng)激損傷精子質(zhì)膜完整性和流動性，最終損傷精子核 DNA[19]。男性隨著年齡增加而引起的精子DNA損傷，將會影響胚胎發(fā)育，除導致不良的輔助生殖結(jié)局外，還增加胎兒出生缺陷發(fā)生及子代異常的風險[20-21]。可見，加強精子DNA完整性的檢測，對于評價男性不育具有重要的作用。

精子活力和精子正常形態(tài)率作為精液常規(guī)分析中的兩個重要參數(shù)，也反映著男性的生育力。本研究中，精子DFI與精子活力、精子正常形態(tài)率呈負相關(guān)，與新疆[22]、深圳[23]、上海[24]、沈陽[25]等多地區(qū)對男性不育患者的年齡、精液參數(shù)與其精子DFI相關(guān)性的研究結(jié)論一致。精子線粒體作為調(diào)節(jié)精子運動的主要細胞器，提供精子運動所需主要能量來源，在精子DNA損傷后該細胞器產(chǎn)生的能量異常會導致精子活動能力的下降[26]，而引起男子不育。還有學者認為，過多的精子DNA鏈斷裂，可誘導精子細胞凋亡，反映在精子形態(tài)結(jié)構(gòu)、精子活動率以及前向運動精子等活動狀態(tài)[27]。本研究結(jié)果中，精子DFI與精液量、精子總數(shù)呈正相關(guān)，但精子濃度與精子DFI關(guān)系分析無統(tǒng)計學意義。在很多學者的研究結(jié)果中，精液量和精子濃度與DFI的關(guān)系是有爭議的，但對精子總數(shù)與DFI的關(guān)系研究不多。自然受孕或輔助生殖助孕過程中，除精子活力外，一次射精的總數(shù)仍起重要作用。臨床檢驗過程中，因檢測方式的局限性，對于精子濃度極低的標本，無法進行精子DFI的檢測。因此，不排除是因樣本選擇的局限性導致精子濃度與DFI的陰性結(jié)果。另外，本研究結(jié)果顯示，禁欲時間、液化時間等與精子DFI均呈正相關(guān)，與此前研究結(jié)果一致[28]?？紤]因精液中精子細胞是ROS的主要內(nèi)源性來源[29]，隨著禁欲時間延長，精液量相對增多，累積的精子總數(shù)亦增多，引起內(nèi)源性ROS增高，從而導致DFI增高。

本研究分析了精子DFI與年齡、精液常規(guī)等兩兩之間的關(guān)系，為了更直觀的了解到各參數(shù)對DFI影響更直觀的結(jié)果，將相關(guān)性較高且學者們關(guān)注的較多的男性年齡、精子總數(shù)、活力、正常形態(tài)率等因素進一步進行多因素分析，得到了具有極顯著統(tǒng)計學意義的結(jié)果，并可以根據(jù)回歸方程在一定程度上預(yù)測其對應(yīng)精子DFI情況。

綜上所述，精子DNA完整性與年齡及精子總數(shù)、活力、正常形態(tài)率等均相關(guān)，年齡是導致DFI升高的關(guān)鍵因素，DFI升高亦可導致精子活力與正常形態(tài)率等下降。精子DFI結(jié)合精液常規(guī)檢查能更好地評估男性生育力，為進一步的研究精子DFI與男性不育等更深入的機制研究提供了理論基礎(chǔ)。本次研究尚存在不足，如未納入精子濃度<5×106/ml的標本，未依據(jù)年齡和精子DFI進行更細化的分組。今后有必要擴大檢測地域，加大樣本量，并進行更細化的分組等深入研究。