蘇俊玲 烏云 楊文靜 張燕

宮頸癌(cervical cancer, CC)是全球主要影響女性生殖健康的惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國家，CC病理檢測占世界女性癌癥死亡病例的60%以上[1-2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染、遺傳變異、營養(yǎng)不良和免疫功能紊亂等是CC發(fā)生發(fā)展的重要驅(qū)動因子，其中，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是浸潤性CC的重要發(fā)病誘因，特別是HPV16和HPV18[3-4]。流行病學(xué)研究表明，99.4%的CC患者感染該HPVs病毒[5]。然而，目前基于HPV的CC的診斷及各種治療結(jié)果并不能獲得良好的效果，因此進一步揭示CC的發(fā)生發(fā)展及治療迫在眉睫[6]。

微小RNAs(MicroRNAs，miRNAs)是一類長度約為19至24個核苷酸的單鏈和非編碼小RNA分子，其通過形成不完全堿基配對靶信使RNA進行降解或翻譯抑制的基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，已被證明參與多種細胞生長調(diào)控和生理病理功能，并且可作為生物標(biāo)記物(biomakers)用于診斷疾病發(fā)生和監(jiān)測疾病發(fā)展[7]。研究顯示，miR-21高表達于CC，且通過調(diào)控TIMP3、PTEN/AKT通路、腫瘤壞死因子-alfa(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等參與調(diào)控CC細胞增殖、凋亡和遷移[8-9]。miR-21更具有改善耐藥性和調(diào)控細胞自噬等多種作用，因此在CC治療與診斷應(yīng)用方面前景廣闊[10-11]。

Cylindromatosis(CYLD)是一種腫瘤抑制基因，在稱為圓柱狀瘤病的良性皮膚腫瘤綜合征中發(fā)生突變，其表達產(chǎn)物為去泛素化酶，主要通過抑制NF-κB信號傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)細胞增殖、細胞存活和炎癥反應(yīng)[11]。CYLD作為腫瘤抑制分子參與調(diào)控細胞周期、下調(diào)促癌基因(Proto-oncogene)BCl-3表達，并且在肺癌細胞中的表達受到miR-21調(diào)控[12]。然而，miR-182-5p作為CYLD的又一調(diào)控分子，其低表達于CC[13-14]。CYLD是否參與CC的發(fā)生發(fā)展及其作用尚不明確，且CC高表達的miR-21是否通過CYLD參與CC細胞生長尚未可知。

因此，本研究擬檢測CC組織與癌細胞中miR-21表達變化和CYLD蛋白表達，并通過干擾miR-21表達，觀察miR-21對CC細胞增殖、細胞周期相關(guān)及CYLD蛋白的影響。

資料與方法

一、資料

選取2016年01月至2018年06月進入內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院救治的56例CC患者和同期健康志愿者67例，收集外周血并分離血漿后與CC患者腫瘤病變組織和癌旁組織共同凍存于-80 ℃?zhèn)溆茫瑱z測HPV16、HPV18和miR-21含量等。本實驗研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者、志愿者均對本研究知情并簽署知情同意書。

人宮頸上皮永生化細胞H8和人CC細胞系：腺癌樣SiHa、HeLa (上皮樣宮頸癌epithelioid cervical carcinoma)和Caski (表皮樣囊腫宮頸, epidermoid cervical carcinoma) 以及MS751、C33A、C4-I、C4-II細胞均購自中國科學(xué)院上海細胞庫，Lipo2000、DMEM高糖培養(yǎng)基和cDNA合成試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，胎牛血清購自美國Ausgene公司，TRizol RNA提取試劑盒、RIPA裂解液、Cocktail、磷酸化酶抑制劑、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL顯影液和HRP-山羊抗兔二抗購自武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司)，SYBGreen qPCR Mix購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，CCK-8試劑盒購自天中國碧云天公司，miR-21、U6 qPCR引物和miR-21抑制劑(miR-486-5p inhibitor)購自廣州銳博生物科技有限公司，CCND1、CCNE、CDK4、CDK6和ACTB qPCR引物購自武漢擎科生物科技有限公司，兔抗人CYLD、b-actin、Cyclin D1、Cyclin E1、CDK4和CDK6抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

二、方法

1. HR-HPV檢查：將宮頸外口的分泌物和其他液體清理干凈后，收集分泌物于無菌玻璃管中，采用HPV基因分型檢測試劑盒應(yīng)用q-PCR方法檢測，即(1)將標(biāo)本10 000 rpm室溫離心5 min，棄去上清；(2)向上述管子中加入25 μl DNA提取試劑，混勻后，95 ℃加熱10 min；10 000 rpm室溫離心5 min后上清直接用于q-PCR檢測HPV16、HPV18；(3)按照試劑盒要求采用ABI 7500檢測；(4)結(jié)果判斷。CT值<35的樣本，即為高危型HPV陽性(高表達)；反之為高危型HPV陰性(低表達)。

2. 細胞培養(yǎng)：所有細胞系42℃復(fù)蘇后，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胰酶消化計數(shù)后，以2×104個/孔接種于96孔板中，加入10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h用于干預(yù)實驗。

3. 轉(zhuǎn)染實驗：取miR-21抑制劑(inhibitor)和陰性對照類似物(negative control，NC)干粉，依照說明加入無菌TE溶液溶解至50 mM。取兩支1.5 ml Ep管，各加入100 μl Opti-MEM后分別加入miR-21抑制劑(inhibitor)或NC和5 μl Lipo2000，混勻后室溫孵育3 min，并將兩者混合再室溫孵育20 min，滴加入細胞中繼續(xù)培養(yǎng)進行檢測。

4. CCK-8實驗：以終濃度為10 nM的miR-21抑制劑(inhibitor)和NC轉(zhuǎn)染預(yù)先接種至96孔板培養(yǎng)24 h的H8、Hela、C4-I和Caski細胞2 h、24 h、48 h和72 h，加入CCK-8溶液后，37 ℃孵育1 h，采用酶標(biāo)儀測定 450 nm 的吸光值(OD450)。每組設(shè)6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

5.qRT-PCR實驗：以含TRizol RNA 500 μl提取處理后的12孔板細胞，并使用NanoDrop2000對總RNA濃度和純度進行檢測。參照cDNA合成試劑盒操作步驟將500 ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取10 ng cDNA作模版，25 μl qRT-PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)程序為95℃ 2 min、95℃ 5s、60℃ 30 s，擴增35個循環(huán)，引物序列見表1。以U6為內(nèi)參，采用2△△Ct法計算miR-21相對表達量，以ACTB為內(nèi)參計算CCND1、CCNE、CDK4、CDK6 mRNA的相對表達量。

6.Western blot實驗：以含PMSF的RIPA裂解液100 μl裂解12孔板細胞。超聲破碎后，4℃ 14 000 g離心20 min，上清以BCA法檢測蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液，95℃干熱變性10 min。20 μg變性蛋白進行10% SDS-PAGE分離后，200 mA 2 h轉(zhuǎn)移至0.45 μm的PVDF膜，2% BSA TBST溶液封閉30 min，孵育一抗(Cyclin D1、Cyclin E1、CDK4、CDK6、和CYLD稀釋比為1∶750；b-actin稀釋比為1∶1 000)，4℃過夜，TBST漂洗3次，二抗(稀釋比為1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL顯影。

表1 q-PCR引物序列及產(chǎn)物大小Table 1 q-PCR primers sequence and product size

結(jié) 果

一、CC病人血漿中HPV16和HPV18、血漿和癌組織miR-21含量檢測

如圖1所示，CC患者血漿中HPV16和HPV18高表達(P<0.05)，其癌組織中miR-21含量顯著高于癌旁組織(P<0.05)，且血漿中miR-21含量顯著高于健康人(P<0.05)。

二、CC病人癌組織與血漿中miR-21與HPV16，HPV18和腫瘤尺寸相關(guān)性分析

檢測CC患者血漿HPV16、HPV18水平和腫瘤尺寸并將其與CC組織和血漿miR-21含量作Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CC患者血漿HPV16、HPV18水平和腫瘤尺寸與血漿和癌組織miR-21含量成顯著正相關(guān)性(P<0.001)。 見圖2。

Notes:Compared with controls, *P<0.05圖1 CC病人癌組織與血漿中高表達HPV16，HPV18和miR-21Figure 1 High expression of HPV16, HPV18 and miR-21 in cancer tissues and plasma of CC patients

Notes:***P<0.001圖2 CC病人癌組織與血漿中miR-21與HPV16, HPV18和腫瘤尺寸呈正相關(guān)Figure 2 There is a positive correlation between miR-21, HPV16 and HPV18 in tumor tissue and plasma with tumor size in CC patients

三、人CC細胞系miR-21含量檢測

檢測多種CC細胞系的miR-21含量，發(fā)現(xiàn)人CC細胞系C4-I、C4-II、Hela、SiHa、C33A、Caski和MS751相比于正常細胞H8均高表達miR-21(P<0.05)，且通過miR-21抑制劑(inhibitor)處理，Hela細胞中miR-21含量顯著降低，且具有劑量依賴性(P<0.05)。見圖3。

四、miR-21抑制劑(inhibitor)對正常和CC細胞生長影響

通過給予H8、Hela、C4-I、Caski細胞10 nM的miR-21抑制劑(inhibitor)處理2 h、24 h、48 h和72 h后，相比Control處理組，H8細胞miR-21水平均沒有明顯的變化(P>0.05)。而Hela、C4-I、Caski細胞細胞增殖率逐漸降低(P>0.05)，見圖4。

五、下調(diào)miR-21對人CC Hela和Caski細胞周期相關(guān)蛋白表達的影響

為進一步探究下調(diào)miR-21對人CC Hela和Caski細胞增殖影響，檢測細胞周期相關(guān)蛋白及其mRNA變化，結(jié)果如圖5所示，人CC Hela和Caski細胞miR-21抑制劑組CyclinD1、CyclinE、CDK4蛋白和mRNA(CCND1、CCNE、CDK4)水平明顯高于Control組(P<0.05)，Caski細胞miR-21抑制劑組CDK6蛋白和mRNA顯著降低(P<0.05)，而Hela細胞miR-21抑制劑組的CDK6蛋白和mRNA無明顯變化(P>0.05)。

六、下調(diào)miR-21對人CC Hela和Caski細胞CTLD蛋白表達的影響

為了研究miR-21對人CC Hela和Caski細胞周期調(diào)控的潛在機制，借助Western Blot檢測Control和miR-21抑制劑轉(zhuǎn)染處理24 h的人CC Hela和Caski細胞的CYLD蛋白和mRNA變化情況。miR-21抑制劑轉(zhuǎn)染處理24 h的人CC Hela和Caski細胞中CYLD蛋白和mRNA水平均明顯高于Control組(P<0.05)。見圖6。

Notes:Compared with controls or H8, *P<0.05圖3 人CC細胞系高表達miR-21Figure 3 miR-21 expression levels in human CC cell line

Notes:Compared with 2h, *P<0.05圖4 下調(diào)miR-21抑制人CC細胞系增殖Figure 4 Down-regulation of miR-21 inhibits proliferation of human CC cell lines

Notes:Compared with control, *P<0.05圖5 下調(diào)miR-21抑制人CC細胞系細胞周期相關(guān)蛋白表達Figure 5 Down-regulation of miR-21 inhibits cell-cycle-associated protein expression in human CC cell lines

Notes:Compared with control, *P<0.05圖6 下調(diào)miR-21促進人CC細胞系細胞CYLD蛋白表達Figure 6 Down-regulation of miR-21 promotes CYLD protein expression in human CC cell lines

討 論

除了尋找新的CC診斷標(biāo)志物外，進一步了解CC發(fā)生的病理分子機制對于開發(fā)更有針對性和有效的治療方法是至關(guān)重要的。近些年來，miRNA作為用于鑒別和診斷疾病的新發(fā)現(xiàn)，特別是作為慢性病和癌癥的生物標(biāo)記物(Biomarkers),其在神經(jīng)科學(xué)和癌癥發(fā)病機制研究中具有舉足輕重的地位[7]。

CC的發(fā)病率在發(fā)展中國家?guī)缀跽剂巳虻?0%，嚴重影響人類健康，給政府的衛(wèi)生系統(tǒng)帶來負擔(dān)，迫切需要有效的治療干預(yù)措施[2]。然而，由于CC發(fā)展的精細分子機制現(xiàn)在仍不清楚，其靶向治療非常有限[1]。本研究CC患者外周血和癌組織高表達miR-21，其和升高的感染因子HPV16、HPV18含量及人體腫瘤體積呈現(xiàn)明顯正相關(guān)性，說明miR-21可能成為與HPV16、HPV18相似的HCC診斷指標(biāo)，可作為又一CC診斷與治療評估指標(biāo)，且參與CC發(fā)生發(fā)展，即腫瘤生長。并且發(fā)現(xiàn)其作為CC增殖的主要參與miRNA分子，高表達于多種公認的高度遷移、活化及增殖的CC細胞系；其次細胞轉(zhuǎn)染實驗，顯示下調(diào)miR-21抑制多種CC細胞增殖，而不影響正常宮頸上皮細胞，說明其潛在的特異性。同時，文獻報道稱miR-21具有調(diào)控多種細胞增殖的潛能，包括影響細胞周期[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)CC細胞高表達的miR-21可顯著阻斷CyclinD1-CDK4與CyclinE-CDK2復(fù)合物形成，抑制細胞周期，阻斷G1向S期過渡[9]，同時證實此效應(yīng)與上調(diào)腫瘤抑制分子CYLD有關(guān)[15]，為miR-21在CC研究及未來的臨床應(yīng)用提供又一有利支持。然而，由于miR-21在CC存在多態(tài)性，且作用于CCSTAT3和TIMP3多種分子[10, 16]，因此仍有待進一步研究。

綜上所述，CC組織與癌細胞高表達的miR-21可能通過抑制CYLD蛋白介導(dǎo)癌細胞周期阻滯促進細胞增殖，同時，其可作為生物標(biāo)記物參與CC的診斷和治療監(jiān)測。