宋英倫,郭志新,楊李莉,馮勁宜,石文姣

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科,太原 030001;*通訊作者,E-mail:zhxguo1966@163.com)

糖尿病性心肌病是糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一,是導(dǎo)致糖尿病患者致死致殘的主要原因之一[1]。研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平增高和自噬水平降低與糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2,3]。脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì),具有抗炎、抗糖尿病和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。研究發(fā)現(xiàn),脂聯(lián)素對(duì)糖尿病心臟具有保護(hù)作用[4,5],其作用機(jī)制目前尚不清楚。脂聯(lián)素是否通過(guò)調(diào)節(jié)自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)糖尿病心臟產(chǎn)生保護(hù)作用,目前國(guó)內(nèi)外罕見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在觀察Ⅰ型糖尿病小鼠心肌組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬水平的變化,探討重組球形脂聯(lián)素是否通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬對(duì)糖尿病小鼠心肌組織產(chǎn)生保護(hù)作用,為臨床防治糖尿病性心肌病變提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

鏈脲佐菌素(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司),重組球形脂聯(lián)素(購(gòu)于武漢艾美捷科技有限公司),血清總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所),血清胰島素檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司)、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)(購(gòu)自瑞士羅氏公司),引物合成(購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司)。

1.2 糖尿病小鼠模型的建立及分組

8周齡雄性C57BL/6J小鼠(SPF級(jí)別,生產(chǎn)許可號(hào)scxk(晉)2015-0001)48只購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體質(zhì)量(20±2)g。在12 h照明12 h黑暗的中心屏障環(huán)境中飼養(yǎng),通風(fēng)好,溫度、濕度適宜,自由飲水和進(jìn)食。所有小鼠在上述環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組,n=8)和糖尿病造模組(n=40)。造模組小鼠先禁食12 h,然后立即腹腔注射鏈脲菌素60 mg/kg(0.1 mmol/L,溶于pH 4.5無(wú)菌檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液),NC組腹腔注射等量檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液,每日1次,連續(xù)注射5 d,繼續(xù)喂養(yǎng)1周后測(cè)隨機(jī)血糖值≥16.7 mmol/L為造模成功[6]。共有24只小鼠造模成功,用隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的小鼠分為糖尿病組(DM組,n=8),糖尿病低劑量脂聯(lián)素干預(yù)組(低劑量組,n=8)和糖尿病高劑量脂聯(lián)素干預(yù)組(高劑量組,n=8)。參照文獻(xiàn)[7,8],低劑量組和高劑量組分別腹腔注射重組球形脂聯(lián)素5 μg/(kg·d)和15 μg/(kg·d)。NC組和DM組給予等量生理鹽水腹腔注射。實(shí)驗(yàn)經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 標(biāo)本采集

重組球形脂聯(lián)素干預(yù)第8周末小鼠禁食10-12 h后稱重,用10%水合氯醛0.1 ml/10 g腹腔注射麻醉,腹主動(dòng)脈采血留取血標(biāo)本,用于血糖、血脂、胰島素水平檢測(cè)。采血后立即處死動(dòng)物,迅速取出心臟組織。心臟組織用生理鹽水沖洗干凈,濾紙吸干水分后稱重,計(jì)算心臟質(zhì)量指數(shù)(心臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)。取部分左室心肌組織用中性甲醛固定,用于HE染色。其余左室心肌組織迅速置入液氮中待組織冷凍完全后儲(chǔ)藏于-70 ℃冰箱待用。

1.4 小鼠血液指標(biāo)檢測(cè)

葡萄糖氧化酶法檢測(cè)血糖,酶偶聯(lián)比色法測(cè)定血清總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG),酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清胰島素。

血糖測(cè)定步驟:采血樣于血糖試紙,用瑞特GM300血糖儀檢測(cè)血糖。

血脂測(cè)定步驟:取試管若干,編號(hào)為空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管,分別加入血清、血脂標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水、酶試劑應(yīng)用液混勻,置于37 ℃水浴中保溫，以空白管調(diào)零,在500 nm處比色,讀取標(biāo)準(zhǔn)管及測(cè)定管吸光度,按照公式計(jì)算得出血脂水平。

血清胰島素測(cè)定步驟:加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品及生物素標(biāo)記抗體溫育,再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的INS抗體溫育,反應(yīng)過(guò)后沖洗掉未結(jié)合部分,再加入底物反應(yīng),之后加入終止液使其轉(zhuǎn)化為黃色。通過(guò)讀取標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值來(lái)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上反算出血清胰島素濃度。

1.5 小鼠心肌組織形態(tài)觀察

心肌組織用10%中性福爾馬林固定,酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,制成5 μm厚切片,HE染色,脫水透明封固,在光鏡下觀察小鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)GRP78、CHOP、Caspase-12和自噬指標(biāo)p62、LC3、Beclin1 mRNA表達(dá)

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定。取50 mg心肌組織，用Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性20 s, 60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)40次。50 μl PCR反應(yīng)體系包括：25 μl SYBR(主要包括dTNP、10×緩沖液、rTaq DNA聚合酶及MgCl2)、1 μl引物、5 μl cDNA和19 μl去離子水。目的基因表達(dá)陽(yáng)性的標(biāo)本熒光定量擴(kuò)增曲線呈S形，從熒光定量PCR儀系統(tǒng)中讀取Ct值。以2-ΔΔCt表示樣品中目的基因mRNA相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)量?；蛞镄蛄幸?jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

Table 1 PCR primer sequences

基因上游引物序列 下游引物序列 引物長(zhǎng)度(bp)GRP785′-ATGATGAAGTTCACTGTGGTGG-3′5′-CTGATCGTTGGCTATGATCTCC-3′174CHOP5′-CTCCAGATTCCAGTCAGAGTTC-3′5′-ACTCTGTTTCCGTTTCCTAGTT-3′80Caspase-125′-TGGCCCATGAATCACATCTAAT-3′5′-TGGACAAAGCTTCAGTGTATCT-3′83LC35′-CCACCAAGATCCCAGTGATTAT-3′5′-TGATTATCTTGATGAGCTCGCT-3′120Beclin15′-TAATAGCTTCACTCTGATCGGG-3′5′-CAAACAGCGTTTGTAGTTCTGA-3′217p625′-TAAGTACCTGCCTGAACTCATG-3′5′-TTCTCAATTTCTACGGACAGCA-3′90

GRP78:葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78;CHOP:C/EBP同源蛋白;Caspase-12:含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-12;LC3:微管相關(guān)蛋白輕鏈3

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠生化指標(biāo)和心臟質(zhì)量指數(shù)的比較

與NC組比較,DM組小鼠血糖、血脂、心臟質(zhì)量指數(shù)(心臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)顯著升高(P<0.05),血清胰島素水平顯著降低(P<0.05)。與DM組比較,低劑量組小鼠血糖、血脂、心臟質(zhì)量指數(shù)顯著降低(P<0.05),而血清胰島素水平無(wú)明顯變化(P>0.05)。與DM組比較,高劑量組小鼠血糖、血脂、心臟質(zhì)量指數(shù)顯著降低,血清胰島素水平顯著升高(P<0.05)。與低劑量組比較,高劑量組小鼠血糖水平降低,血清胰島素水平升高(P<0.05),而血脂、心臟質(zhì)量指數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05,見(jiàn)表2)。

表2 小鼠血糖、血脂、胰島素和心臟質(zhì)量指數(shù)比較

Table 2 Comparison of blood glucose, blood lipid, insulin and cardiac mass index in mice among four groups

組別nFPG(mmol/L) FIN (pg/ml)TC(mmol/L)TG(mmol/L)心臟質(zhì)量 指數(shù)(%) NC組8 6.45±0.86798.95±107.582.28±0.600.27±0.030.41±0.01DM組819.49±2.40a383.81±38.48a4.27±0.43a0.66±0.17a0.47±0.01a低劑量組812.49±2.70ab465.00±16.50a3.54±0.13ab0.43±0.03ab0.40±0.03b高劑量組8 9.74±0.82abc579.07±46.32abc2.97±0.47ab0.33±0.03b0.43±0.02b F867.89 42.01 18.46 18.08 9.22 P8<0.001<0.001<0.001<0.0010.01

與NC組比較,aP<0.05;與DM組比較,bP<0.05;與低劑量組比較,cP<0.05

2.2 小鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化

心肌組織HE染色結(jié)果顯示:NC組小鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰,排列整齊而致密,無(wú)明顯肥大、斷裂表現(xiàn),細(xì)胞核分布均勻呈圓形或橢圓形,細(xì)胞間質(zhì)少。DM組小鼠心肌纖維肥大、腫脹明顯,排列紊亂,邊界不清,可見(jiàn)部分心肌纖維斷裂及局部炎細(xì)胞浸潤(rùn),細(xì)胞核大小不等,排列無(wú)序,細(xì)胞間質(zhì)明顯增多。低劑量組小鼠心肌纖維仍可見(jiàn)肥大、腫脹,但程度較DM組小鼠減輕,排列較DM組小鼠稍整齊,仍可見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)及心肌間質(zhì)增多。高劑量組小鼠心肌纖維無(wú)明顯肥大、腫脹、斷裂,排列較整齊,未見(jiàn)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn),細(xì)胞核分布較均勻,心肌間質(zhì)大致正常(見(jiàn)圖1)。

A.正常對(duì)照組;B.糖尿病組;C.低劑量脂聯(lián)素干預(yù)組;D.高劑量脂聯(lián)素干預(yù)組圖1 小鼠心肌組織HE染色結(jié)果 (×400)Figure 1 HE staining results of myocardial tissue in mice (×400)

2.3 小鼠心肌組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)GRP78、CHOP、Caspase-12 mRNA表達(dá)水平

與NC組比較,DM組小鼠心肌組織Caspase-12、GRP78和CHOP mRNA表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)。與DM組比較,低劑量組小鼠心肌組織Caspase-12和GRP78 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),而CHOP mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05)。與DM組比較,高劑量組小鼠心肌組織Caspase-12、GRP78和CHOP mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與低劑量組比較,高劑量組小鼠心肌組織Caspase-12、GRP78和CHOP mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05,見(jiàn)表3)。

2.4 小鼠心肌組織自噬指標(biāo)Beclin 1、LC3和p62 mRNA表達(dá)水平

與NC組比較,DM組小鼠心肌組織Beclin 1和LC3 mRNA表達(dá)水平顯著降低,p62 mRNA表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)。與DM組比較,低劑量組小鼠心肌組織Beclin 1 mRNA表達(dá)水平顯著升高,p62 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),而LC3 mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05)。與DM組比較,高劑量組小鼠心肌組織Beclin 1和LC3 mRNA表達(dá)水平顯著增高,p62 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與低劑量組比較,高劑量組小鼠心肌組織Beclin 1和LC3 mRNA表達(dá)水平顯著增高,p62 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05,見(jiàn)表4)。

表3 小鼠心肌組織GRP78、CHOP、Caspase-12 mRNA表達(dá)水平

Table 3 Comparison of GRP78, CHOP and Caspase-12 mRNA levels in myocardial tissues of mice among four groups

組別nGRP78CHOPCaspase-12NC組80.19±0.030.44±0.530.10±0.01DM組81.00±0.05a1.06±0.08a1.01±0.05a低劑量組80.53±0.04ab1.00±0.07a0.63±0.03ab高劑量組80.39±0.08abc0.75±0.01abc0.18±0.04abc F8130.2563.44442.07 P8<0.001<0.001<0.001

與NC組比較,aP<0.05;與DM組比較,bP<0.05;與低劑量組比較,cP<0.05

表4 小鼠心肌組織Beclin1、LC3、p62 mRNA表達(dá)水平

Table 4 Comparison of Beclin1, LC3 and p62 mRNA expression levels in myocardial tissues of mice among four groups

組別nBeclin 1LC3p62NC組81.00±0.091.11±0.110.26±0.01DM組80.26±0.02a0.58±0.08a1.00±0.03a低劑量組80.67±0.12ab0.70±0.04a0.86±0.03ab高劑量組80.89±0.10bc1.01±0.13bc0.71±0.08abc F842.0320.98152.23 P8<0.001<0.001<0.001

與NC組比較,aP<0.05;與DM組比較,bP<0.05;與低劑量組比較,cP<0.05

3 討論

自噬是細(xì)胞利用溶酶體對(duì)細(xì)胞內(nèi)可溶性大分子物質(zhì)以及受損的細(xì)胞器進(jìn)行降解、更新和再利用的過(guò)程[3,9]。研究發(fā)現(xiàn),糖尿病心肌自噬功能降低,自噬功能紊亂與糖尿病性心肌病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3,9,10]。在自噬過(guò)程中,由自噬相關(guān)基因12(Atg12)和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)組成的兩條泛素化過(guò)程將會(huì)用來(lái)修飾擴(kuò)展由Bcl-2相互作用蛋白(Beclin 1)誘導(dǎo)形成的自噬小體,并與LC3配體-自噬適配子蛋白p62相互作用最終完成底物降解,因而檢測(cè)Beclin1、LC3、p62水平能反應(yīng)自噬水平的高低。本研究結(jié)果顯示,糖尿病小鼠心肌組織LC3和Beclin1mRNA表達(dá)水平顯著降低,p62 mRNA表達(dá)水平顯著升高,提示糖尿病小鼠心肌組織自噬水平降低。糖尿病小鼠心肌細(xì)胞病理改變明顯,心臟質(zhì)量指數(shù)顯著增大,由此我們猜測(cè)自噬水平受到抑制可能與糖尿病小鼠心肌組織受到損傷有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),敲除脂聯(lián)素的老年雄性小鼠在壓力過(guò)負(fù)荷時(shí)心功能紊亂與自噬缺乏有關(guān)[10]。過(guò)表達(dá)脂聯(lián)素受體1可減少高脂飲食所致肥胖小鼠心肌脂質(zhì)蓄積及心肌肥厚,其機(jī)制與促進(jìn)自噬有關(guān)[11]。脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑通過(guò)AMPK依賴和非依賴途徑恢復(fù)糖尿病小鼠心肌缺血再灌注損傷的自噬水平,對(duì)糖尿病心肌產(chǎn)生保護(hù)作用[9]。脂聯(lián)素是否通過(guò)調(diào)節(jié)自噬對(duì)糖尿病心肌產(chǎn)生保護(hù)作用,目前國(guó)內(nèi)外罕見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示,脂聯(lián)素干預(yù)后,低劑量組糖尿病小鼠心肌組織Beclin1 mRNA表達(dá)水平顯著升高,p62 mRNA表達(dá)水平顯著降低,而LC3 mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化;高劑量組糖尿病小鼠心肌組織LC3和Beclin1 mRNA表達(dá)水平顯著升高,p62 mRNA表達(dá)水平顯著降低;高劑量組效果優(yōu)于低劑量組,提示脂聯(lián)素可能通過(guò)激活自噬對(duì)糖尿病小鼠心肌產(chǎn)生保護(hù)作用,且這種保護(hù)作用具有劑量依賴性。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指機(jī)體在一系列病理生理因素刺激下出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂,進(jìn)而激活相關(guān)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),以應(yīng)對(duì)條件的變化和恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)良好的蛋白質(zhì)折疊環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn),糖尿病心臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平增高,過(guò)強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)對(duì)心肌組織造成一定的損傷,故而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在糖尿病心肌病變的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[2,12-15]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)異常時(shí),應(yīng)激感受蛋白與ERS分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)分離活化,促進(jìn)下游內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡基因C/EBP同源蛋白(CHOP)和半胱氨酸蛋白酶(Caspase-12)等凋亡信號(hào)的表達(dá),從而引起細(xì)胞凋亡[16,17],因而GRP78、CHOP、Caspase-12水平可反應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平。本研究結(jié)果顯示,糖尿病小鼠心臟GRP78、CHOP和Caspase-12 mRNA表達(dá)水平顯著升高,表明糖尿病小鼠心臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平升高,提示糖尿病小鼠心肌受損可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平升高有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期缺乏自噬時(shí),受損的細(xì)胞器和未折疊蛋白會(huì)大量積聚,從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加,導(dǎo)致細(xì)胞受損甚至死亡[18]。因此,本實(shí)驗(yàn)糖尿病小鼠心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平增加可能與自噬受到抑制有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),脂聯(lián)素通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕缺氧/復(fù)氧、慢性間歇性缺氧和缺血再灌注對(duì)心肌細(xì)胞和心肌的損傷,對(duì)心肌細(xì)胞和心肌產(chǎn)生保護(hù)作用[13-15]。脂聯(lián)素類似物CTRP9通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕心臟缺血再灌注損傷,對(duì)糖尿病大鼠心臟產(chǎn)生保護(hù)作用[12]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,脂聯(lián)素干預(yù)后,低劑量組糖尿病小鼠心臟GRP78和Caspase-12 mRNA表達(dá)水平顯著降低,而CHOP mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化;高劑量組糖尿病小鼠心臟GRP78、Caspase-12和CHOP mRNA表達(dá)水平均顯著降低;高劑量組效果優(yōu)于低劑量組,提示脂聯(lián)素可能通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)糖尿病小鼠心臟產(chǎn)生保護(hù)作用,這種保護(hù)作用具有劑量依賴性。研究發(fā)現(xiàn),脂聯(lián)素通過(guò)誘導(dǎo)自噬調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕對(duì)乙酰氨基酚對(duì)肝細(xì)胞的損傷,對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用[19]。本研究結(jié)果顯示,脂聯(lián)素干預(yù)后,糖尿病小鼠自噬水平顯著升高,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平顯著降低,心臟質(zhì)量指數(shù)顯著降低,病理改變顯著減輕,提示脂聯(lián)素可能通過(guò)增強(qiáng)自噬進(jìn)而降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平對(duì)糖尿病小鼠心臟產(chǎn)生保護(hù)作用。

綜上所述,糖尿病小鼠心肌組織自噬水平降低,內(nèi)應(yīng)網(wǎng)應(yīng)激水平升高,脂聯(lián)素可能通過(guò)激活自噬及減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)糖尿病小鼠心肌組織產(chǎn)生保護(hù)作用。