常 盼,張曉萌,于 軍,吳 娟,李 靜,趙?？?王西輝,鐵 茹,朱蕭玲

(1西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,西安 710038;2空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院麻醉科;*通訊作者,E-mail:Caribbean-66@126.com)

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是一種以高死亡率和高發(fā)病率為特征的神經(jīng)疾病,每10萬(wàn)人中其發(fā)病約為24.6人,死亡率約為30%-50%[1]。腦出血后繼發(fā)性腦損傷是影響腦出血患者生活質(zhì)量的重要因素[2],因此,預(yù)防腦出血后繼發(fā)性腦損傷非常有價(jià)值,研究腦出血后繼發(fā)性腦損傷的分子機(jī)制可為臨床治療提供新的靶點(diǎn),腦出血后神經(jīng)損傷和凋亡是腦出血后繼發(fā)性腦損傷的重要病理過(guò)程[3]。熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid, UDCA)是內(nèi)源性膽汁酸,在過(guò)去幾十年中用于治療某些肝臟性疾病[4]。然而,近些年來(lái)已經(jīng)證明UDCA及其共軛衍生物?；切苋パ跄懰?TUDCA),在調(diào)節(jié)凋亡中發(fā)揮獨(dú)特作用,尤其是在腦外傷損傷中[5],但其在腦出血損傷中的具體作用和機(jī)制仍然不清楚。為此,在本研究中,采用膠原酶Ⅶ誘導(dǎo)小鼠腦出血,探究TUDCA對(duì)小鼠腦出血的神經(jīng)保護(hù)作用包括腦組織含水量和神經(jīng)功能的影響及其對(duì)凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)8周齡雄性C57BL/6小鼠,18-20 g,購(gòu)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,采用隨機(jī)對(duì)照將小鼠分為假手術(shù)組(Sham組),腦出血組(ICH組),腦出血+TUDCA 50 mg/kg處理組(ICH+TUDCA 100 mg/kg),腦出血+TUDCA 100 mg/kg處理組及腦出血+TUDCA 200 mg/kg處理組(ICH+TUDCA 200 mg/kg),每組24只,術(shù)前12 h禁食,但自由進(jìn)水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

TUDCA,Ⅶ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天生物科技有限公司;TRIzol及Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and SYBR qRT-PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司,引物合成由上海生工完成,引物序列見(jiàn)表1。腦立體定位儀購(gòu)自北京眾實(shí)迪創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司;干燥箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek;實(shí)時(shí)熒光定量PCR購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 腦出血模型的建立及處理

小鼠腦出血模型的制備參照Takagie等[6]采用Ⅶ型膠原酶的方法。將動(dòng)物麻醉后固定于立體定位儀,1 μl含0.2 U的膠原酶Ⅶ 5 min內(nèi)緩慢注入右紋狀體內(nèi),注射點(diǎn)位于前囟前0.2 mm,深度0.3 mm處,留針5 min,拔針5 min。假手術(shù)組將1 μl的生理鹽水注入右紋狀體中,TUDCA處理組在造模前1 h和造模結(jié)束后3 h緩慢注射入模型鼠的內(nèi)頸動(dòng)脈。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

名稱正向引物反向引物大小(bp)Bcl-25′-AGCATGCGACCTCTGTTTGA-3′5′-GCCACACGTTTCTTGGCAAT-3′433Bax5′-TGGTTGCCCTTTTCTACTTTG-3′5′-GAAGTAGGAAAGGAGGCCATC-3′167Bcl-xL5′-AGGTCGGCGATGAGTTTGAA-3′5′-CGGCTCTCGGCTGCTGCATT-3′337β-actin5′-TGCCCATCTATGAGGGTTACG-3′5′-TAGAAGCATTTGCGGTGCACG-3′640

1.4 神經(jīng)功能的評(píng)估

小鼠腦出血神經(jīng)功能損傷的評(píng)估分別在腦出血后1,3,5,7 d進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)方法采用神經(jīng)功能缺損評(píng)分(NDS)來(lái)進(jìn)行,具體參照何洋等[7]的方法,主要測(cè)試內(nèi)容包括行走、平衡、感覺(jué)、提尾反射等。

1.5 小鼠腦組織含水量的檢測(cè)

小鼠腦組織含水量的檢測(cè)方法采用本課題組之前報(bào)道的方法[8],采用五分法檢測(cè),即在小鼠腦出血1 d后,將小鼠腦組織分為傷側(cè)及對(duì)側(cè)皮質(zhì)、傷側(cè)及對(duì)側(cè)紋狀體、小腦五部分,隨即稱重,然后放入100 ℃烘箱中烘干1 d后,取出稱重,計(jì)算腦組織含水量,腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重100%。

1.6 腦組織caspase-3活性的檢測(cè)

采用caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)caspase-3活性,首先裂解組織并進(jìn)行勻漿,離心取上清,加入適量的染色劑,37 ℃孵育60 min,利用酶標(biāo)儀在405 nm處進(jìn)行測(cè)量,計(jì)算caspase-3活性。

1.7 腦組織bcl-2、bcl-xL及bax mRNA的檢測(cè)

腦出血1 d或3 d后取腦組織,腦組織中總RNA的提取使用TRIzol試劑,反轉(zhuǎn)錄以及Real Time PCR依照Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and SYBR qRT-PCR的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,主要包括去除基因組DNA,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及Real Time PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s,變性95 ℃ 5 s,退火56 ℃ 30 s,重復(fù)變性和退火步驟40次,解離95 ℃ 15 s。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TUDCA對(duì)小鼠腦出血后腦組織含水量變化的影響

在小鼠腦出血1 d后,腦出血后基底節(jié)區(qū)和皮質(zhì)區(qū)高于假手術(shù)組(P<0.01),經(jīng)50 mg/kg的TUDCA處理后未改變腦出血后腦組織含水量(P>0.05),經(jīng)100 mg/kg或200 mg/kg的TUDCA處理后,皮質(zhì)區(qū)和基底節(jié)區(qū)腦組織含水量均降低(P<0.05,見(jiàn)圖1)。

與sham組相比,**P<0.01;與ICH組相比,#P<0.05圖1 各組小鼠腦出血后腦組織含水量的變化Figure 1 Changes of water content in cerebral tissue after cerebral hemorrhage in mice in five groups

2.2 TUDCA對(duì)小鼠腦出血后神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果的影響

腦出血1,3,5,7 d神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著高于假手術(shù)組(P<0.01);腦出血1 d,50 mg/kg或100 mg/kg TUDCA未改變腦出血后神經(jīng)功能缺損評(píng)分(P>0.05),而200 mg/kg TUDCA可以降低神經(jīng)功能缺損評(píng)分(P<0.05);在腦出血3 d,50 mg/kg TUDCA未改變腦出血后神經(jīng)功能缺損評(píng)分(P>0.05),而100 mg/kg或200 mg/kg TUDCA均可以降低神經(jīng)功能缺損評(píng)分(P<0.05);在腦出血5 d或7 d,50 mg/kg,100 mg/kg或200 mg/kg TUDCA均未改變神經(jīng)功能缺損評(píng)分(P>0.05,見(jiàn)圖2)。

與sham組相比,**P<0.01;與ICH組相比,#P<0.05圖2 各組小鼠腦出血后神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果比較Figure 2 Comparison of scores of neurological deficits after cerebral hemorrhage among five groups

2.3 TUDCA對(duì)小鼠腦出血凋亡的影響

腦出血1 d與3 d后,caspase-3的活性較假手術(shù)組顯著增加(P<0.01),50 mg/kg TUDCA未改變腦出血后caspase-3的活性(P>0.05),而100 mg/kg或200 mg/kg TUDCA均可以減少腦出血后caspase-3的活性(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

與sham組相比,**P<0.01;與ICH組相比,#P<0.05圖3 各組小鼠腦出血后caspase-3活性的改變Figure 3 Comparison of caspase-3 activity after cerebral hemorrhage in mice among five groups

2.4 TUDCA對(duì)小鼠腦出血Bcl-2家族的影響

RT-PCR結(jié)果顯示,在腦出血1 d和3 d,bcl-2和bcl-xLmRNA的表達(dá)較假手術(shù)組顯著升高(P<0.01),而bax mRNA則沒(méi)有變化(P>0.05,見(jiàn)圖4)。在腦出血1 d和3 d,50 mg/kg或100 mg/kg TUDCA未改變bcl-xLmRNA的表達(dá)(P>0.05,見(jiàn)圖4),而200 mg/kg TUDCA可降低腦出血bcl-xLmRNA的表達(dá)(P<0.05,見(jiàn)圖4)。在腦出血3 d,50 mg/kg,100 mg/kg及200 mg/kg TUDCA均可增加bcl-2的轉(zhuǎn)錄激活水平(P<0.05,見(jiàn)圖4)。

與sham組相比,**P<0.01;與ICH組相比,#P<0.05圖4 TUDCA對(duì)小鼠腦出血bax, bcl-xL以及bcl-2 mRNA水平的影響Figure 4 Effects of TUDCA on bax, bcl-xL and bcl-2 mRNA levels after cerebral hemorrhage in mice

3 討論

TUDCA在中醫(yī)有著悠久的歷史,常常被作為治療膽道和肝臟疾病的藥物。腦出血具有較高的致死率和致殘率,預(yù)后往往也較差,主要原因是由于繼發(fā)性腦損傷后引起的血腫,導(dǎo)致缺血、水腫和炎癥等反應(yīng),最終引起細(xì)胞死亡[9]。因此預(yù)防腦出血后水腫的進(jìn)一步擴(kuò)大是治療腦出血的一個(gè)有效有段,腦水腫一般可以通過(guò)腦組織含水量來(lái)衡量,本次研究中首先對(duì)腦水腫進(jìn)行評(píng)估,將小鼠腦組織分為五部分分別檢測(cè)腦組織含水量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)50 mg/kg TUDCA對(duì)腦組織含水量沒(méi)有影響,而100 mg/kg或200 mg/kg TUDCA可以降低腦出血后損傷側(cè)基底節(jié)區(qū)和皮質(zhì)區(qū)腦水腫,結(jié)果提示腦出血后水腫形成的主要原因可能就集中在損傷側(cè)的基底節(jié)區(qū)和皮質(zhì)區(qū),說(shuō)明一定濃度的TUDCA可以降低小鼠腦出血后的腦水腫程度,作用主要集中在損傷側(cè)基底節(jié)區(qū)和皮質(zhì)區(qū)。為了進(jìn)一步探究TUDCA對(duì)腦出血的作用,本次研究還檢測(cè)了TUDCA對(duì)小鼠腦出血后神經(jīng)功能的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)一定濃度的TUDCA處理腦出血小鼠后可以降低神經(jīng)功能缺損評(píng)分,但在3 d后未發(fā)現(xiàn)其對(duì)神經(jīng)功能缺損的影響,說(shuō)明TUDCA對(duì)腦出血的作用可能主要對(duì)急性期有效。結(jié)合以上結(jié)果說(shuō)明,TUDCA對(duì)小鼠腦出血損傷具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用,包括降低腦水腫和降低神經(jīng)功能缺損的評(píng)分,提示TUDCA可能對(duì)包括中風(fēng)等急性神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)揮重要的作用。

腦出血后的細(xì)胞死亡涉及幾種不同途徑的復(fù)雜過(guò)程,包括細(xì)胞凋亡的發(fā)生,抑制細(xì)胞凋亡可能為治療腦出血提供新的治療方案[10]。有報(bào)道稱神經(jīng)功能和水腫與凋亡的發(fā)生也密切相關(guān)[11]。為了進(jìn)一步研究TUDCA對(duì)小鼠腦出血的保護(hù)機(jī)制,本次研究首先檢測(cè)凋亡指標(biāo)caspase-3的變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TUDCA可以降低腦出血后caspase-3活性。Caspase-3的水平是在腦出血伴隨DNA片段化時(shí)發(fā)生的變化,TUDCA是一種有效的細(xì)胞凋亡抑制劑,可以減少大鼠急性腦出血后神經(jīng)元損傷引起的細(xì)胞凋亡[12],最新的文獻(xiàn)報(bào)道,TUDCA對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠認(rèn)知功能損害和神經(jīng)毒性的保護(hù)作用與凋亡密切相關(guān)[13]。TUDCA對(duì)凋亡的影響機(jī)制主要包括可以直接抑制活性氧的產(chǎn)生,抑制跨膜電位崩潰和線粒體外膜破壞[14],還可以通過(guò)抑制Bax從細(xì)胞質(zhì)向線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)以減輕線粒體功能不全和毒性,以及抑制細(xì)胞色素c的釋放,從而減少caspase的活化和底物裂解。此外,TUDCA還可通過(guò)阻斷凋亡途徑來(lái)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[14,15]。但在腦出血中,TUDCA對(duì)凋亡影響的具體機(jī)制和內(nèi)容仍未見(jiàn)報(bào)道。為了進(jìn)一步探究TUDCA對(duì)凋亡的影響,我們檢測(cè)了Bcl-2家族相關(guān)基因的改變,包括促凋亡因子Bax,以及抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL[16],本次結(jié)果發(fā)現(xiàn)TUDCA未改變腦出血后bax mRNA的影響,而降低腦出血后bcl-xLmRNA的表達(dá),增加bcl-2的轉(zhuǎn)錄激活水平。說(shuō)明Bcl-2水平可能通過(guò)激活替代存活通路而保持升高。這些結(jié)果表明,Bcl-2的增加或Bcl-xL的降低與腦出血相關(guān),TUDCA對(duì)腦出血組織的保護(hù)作用與Bcl-2和Bcl-xL相關(guān)?？傊?本研究結(jié)果表明TUDCA可以顯著減少與腦出血相關(guān)的損傷,它似乎通過(guò)激活某些存活途徑來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述,TUDCA可以減輕小鼠腦出血后的腦水腫和神經(jīng)功能缺損,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,其具體的機(jī)制與凋亡反應(yīng)的減輕相關(guān),本次研究為腦出血發(fā)病機(jī)制和治療的基礎(chǔ)研究提供新的思路。