陳 寧,隋云鵬,蘇東寧,魏明豪,孟凡剛*

(1首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院神經外科,北京 100070;2首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院神經內科;*通訊作者,E-mail:fgmeng@ccmu.edu.cn)

α-核突觸蛋白(α-synuclein)是一種在中樞神經系統(tǒng)突觸前及核周表達的可溶性蛋白質,在正常的生理狀態(tài)下是一種天然的未折疊的蛋白質,由140個氨基酸組成。帕金森病(Parkinson disease,PD)是一種常見的中樞神經系統(tǒng)退行性不自主運動疾病,其確切的病理機制目前仍未明確[1,2]。近年研究已發(fā)現α-核突觸蛋白的基因(SNCA)突變會導致罕見的家族型帕金森病的發(fā)生,其產生的毒性作用最終會引起多巴胺神經元的凋亡[3,4],提示α-核突觸蛋白與PD的發(fā)生發(fā)展關系密切。但其確切的分子關聯機制仍未完全揭示。闡明α-核突觸蛋白的病生理機制不僅有助于揭示PD的病理發(fā)生發(fā)展過程、為尋找干預手段治療PD提供分子基礎,而且對于發(fā)現α-核突觸蛋白相關的新的病源亦具有重要意義。

系統(tǒng)生物學是近年基于整體和系統(tǒng)的思想理念提出的。作為系統(tǒng)生物學的重要研究策略和手段,代謝組學是從總體的角度分析一個生物系統(tǒng)中某一類型的所有相對分子質量1 000以內的小分子物質。通過內源性代謝產物的變化,從活性、功能、表達等多個層面反向推理機體內發(fā)生變化的特定生物分子[5-8]。因此,代謝組學可一次同時系統(tǒng)地挖掘變化的分子或其相關的分子調控網絡。本研究借助代謝組的研究工具,通過比較野生型和基因敲除小鼠的體內代謝產物的變化,尋找與這些產物相關的調控通路和生物分子網絡,旨在進一步明確α-核突觸蛋白的生理功能和病理意義,為臨床上診斷和治療α-核突觸蛋白相關性疾病提供新的參考依據和數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器和試劑 DIONEX Ultimate 3000超高效液相色譜儀,Thermo Q EXACTIVE質譜儀，色譜柱：Thermo Syncronis C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm),Milli-Q AdvantageA10型超純水儀(美國Millipore公司)，KQ-250超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。甲醇、乙腈(購于國藥集團)，甲酸均為色譜級(Themo Fisher),-80 ℃冰箱(Themo公司)離心機(Sigma)、電子天平(METTLER TOLEDO)。醋酸纖維素鈉(購于國藥集團)。

1.1.2 動物 Alpha-synucleinA53T雄性純合轉基因(TG)小鼠購自南京大學模式動物研究所(動物合格證編號:N000160),首都醫(yī)科大學實驗動物中心按照SPF級別飼養(yǎng),同時以相應月齡的通窩雄性野生型(WT)小鼠為對照,來自首都醫(yī)科大學動物部。以上動物均適應性飼養(yǎng)1周后進行正式試驗。每次實驗前動物先在超凈臺適應1 h。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥 隨機取10只野生型小鼠以及10只轉基因小鼠,分別為WT組(A)和TG組(B),均常規(guī)喂養(yǎng),自由飲水。實驗動物采用椎脫臼處死法處死。取肝臟組織用生理鹽水清洗,濾紙擦干稱重,置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品采集和處理 采用甲醇 ∶乙腈(1 ∶1)有機溶劑沉淀蛋白法。在肝組織中加入10倍甲醇勻漿 3 min,勻漿液取出100 μl加入甲醇 ∶乙腈(1 ∶1)有機溶劑沉淀蛋白,渦旋30 s,在4 ℃條件下離心15 min(13 000 r/min),取上清液直接進樣分析。

1.2.3 液相色譜(UPLC)條件 儀器名稱：DIONEX Ultimate 3000超高效液相色譜儀,色譜柱：Thermo Syncronis C18 1.7 μm,2.1 mm×100 mm。液相條件：A為水(含0.1%甲酸及2 mmoL/L甲酸銨)，D為乙腈；梯度洗脫，分析時間0-35 min,進樣量10 μl，流速0.3 ml/min。流動相梯度見表1。

表1 液相色譜中梯度條件

Table 1 Gradient conditions for UPLC

時間(min)水(%)乙腈(%)09551.0095516510016.01510018955

1.2.4 質譜(MS/MS2)條件 儀器名稱:Thermo Q EXACTIVE,離子源:ESI(-);監(jiān)測模式:一級全掃描(Full scan),二級數據依賴性掃描(Full MS/dd-MS2);離子源參數:ESI(-),噴霧電壓2 800 V;蒸發(fā)溫度350 ℃;化合物參數:一級全掃描(Full scan),分辨率70 000;二級數據依賴性掃描(Full MS/dd-MS2),分辨率35 000。

1.2.5 質量控制 選擇1 ∶1的乙腈/甲醇混合溶液進行蛋白沉淀處理,以確保盡可能多的代謝產物都溶解。取各組混合樣品,除雜,離心,取上清200 μl,進樣,每5針,平行進一針作為質量控制,以考察儀器的穩(wěn)定性,重復性及樣品的穩(wěn)定性。

1.2.6 數據處理及分析 數據采用mzcloud對小鼠肝組織內源性代謝物質進行鑒定,利用分子式和分子量確定內源性物質,同時在Trace Finder軟件進行自建內源性物質,Metlin,HMDB及KEGG數據庫中進行檢索和確認。采用Metaboanalyst 4.0進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLSDA)及正交偏最小二乘判別分析(Analysis OPLS-DA)和拓撲分析,使用R統(tǒng)計軟件包進行高通量代謝通路分析。最后用Cytoscape及metsape和MCODE插件繪制內源性物質網絡圖模塊化分析。

2 結果

2.1 兩組樣本UPLC-MS數據模式的偏最小二乘法判別分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)識別

采用PLS-DA和Orthogonal PLS-DA分析方法將WT組和TG組肝臟組織代謝組學數據進行分析,結果見圖1。由圖1可知,兩組樣本之間的樣本點相分離,且同一組內各樣本點在一定范圍內聚集較好,提示兩組之間的代謝產物和代謝特征具有明顯的差異。

圖1 WT組和TG組小鼠肝臟組織樣本主成分分析和聚類分析Figure 1 PCA and cluster analysis of liver tissue samples from wild type group and transgenic group

2.2 肝臟組織樣品中的差異代謝物

采用PLS-DA和Orthogonal PLS-DA分析方法得到一個20樣本×461變量的數據矩陣。在PLS-DA模型中提取VIP值最大的前74個變量(VIP值>1.0)。這74個變量的載荷矩陣圖距原點比較大的距離。對這74個變量進行手動積分及非參數檢驗,通過對目標變量進行手動積分,并綜合VIP值、非參數檢驗和ROC曲線的精密度(>0.5)來篩選差異代謝物,確定了27個變量為代謝標志物,結果見表2。

2.3 肝臟組織中差異代謝物的代謝通路分析

將選擇代謝通路影響值的臨界設置為0.10,高于這個值,認為與潛在的靶標路徑關系密切。結果顯示,纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、花生四烯酸代謝、組氨酸代謝、肌醇磷酸代謝通路影響值大于0.10,提示PLS-DA所篩選出的差異代謝物與這幾個代謝途徑存在有密切的相關性,進一步說明α-核突觸蛋白變異后引起的小鼠病理生理變化與苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，甲烷代謝，酪氨酸代謝，組氨酸代謝甘氨酸,絲氨酸和蘇氨酸代謝，苯丙氨酸代謝，甘油磷脂代謝，氨?；?tRNA生物合成等代謝途徑有密切的關系(見表3，圖2)。

表2 α-核突觸蛋白轉基因小鼠肝組織潛在生物標志物的相對含量

Table 2 Relative content of potential biomarkers in liver tissue in transgenic mice

代謝產物 野生型轉基因型 差異倍數P VIP多巴胺1.01±0.6416.39±5.97??16.24↑0.00000022.6816次黃嘌呤4.02±0.538.17±0.42??2.03↑0.0001352081.2829L-丙氨酸1.94±0.181.59±0.17?0.82↓0.0329025622.9765L-組氨酸1.97±0.201.64±0.11?0.84↓0.0320794072.8635L-絲氨酸3.86±0.143.28±0.13?0.85↓0.0261414511.2285L-蘇氨酸6.24±0.165.12±0.19?0.82↓0.0395604211.6521L-酪氨酸1.59±0.161.25±0.19?0.79↓0.0159886783.0632苯乙胺0.78±0.191.49±0.74??1.91↑0.007074961.4746別嘌呤醇5.70±0.194.41±0.22?0.77↓0.0269610615.79261,2,3-丙三羧酸1.55±1.3713.19±6.82??8.53↑0.0030368211.9662-脫氧葡萄糖5.70±0.194.41±0.22?0.77↓0.0269610615.7926肌酸2.38±0.411.61±0.17?0.68↓0.034301294.3791吡啶甲酸5.60±0.4910.29±0.91?1.84↑0.0196400981.1314軟脂酸1.53±0.281.09±0.18?0.72↓0.0136820221.1151抗壞血酸1.55±1.3713.19±6.82??8.53↑0.0030368211.9663-甲基-2-氧代丁酸酯0.99±0.371.60±0.29??1.62↑0.0006016691.4994N-丁?；?L-高絲氨酸內酯2.50±0.637.82±1.81??3.13↑0.0024998261.3394十六烷酸1.53±0.281.09±0.18?0.72↓0.0136820221.1151溶血性磷脂酰乙醇胺(0:0/18:1(9Z))2.90±0.371.92±0.19?0.66↓0.0192773071.6436溶血性磷脂酰乙醇胺(0:0/18:2(9Z,12Z))2.36±0.351.35±0.22??0.57↓0.0043127131.8071溶血性磷脂酰乙醇胺(0:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))6.02±0.274.05±0.15??0.67↓0.0033156672.5509溶血性磷脂酰乙醇胺(20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0:0)6.02±0.274.05±0.15??0.67↓0.0033156672.5509磷脂酰膽堿(14:0/22:0)15.88±1.170.35±0.01?0.02↓0.0164790682.0841磷脂酰膽堿(18:1(11Z)/20:0)10.52±0.652.63±0.16??0.25↓0.002282261.6365磷脂酰膽堿(18:1(9Z)/20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))21.39±0.3014.75±0.32?0.69↓0.0380525441.2798磷脂酰甘油(18:0/18:0)8.37±1.111.84±0.24?0.22↓0.0440031261.2525膽酸14.21±0.864.57±0.20?0.32↓0.0264290791.5881

與WT組相比,*P<0.05,**P<0.01;比率=TG組/WT組,“↑”示較WT組上調倍數,“↓”示較WT組下調倍數;“()”中所示為該代謝產物的碳鏈的碳數、雙鍵數目及其相應位置,不同碳鏈通過“/”分隔

表3 構建的分析通路(Impact>0.10)

Table 3 Constructed analytical pathway(Impact>0.10)

代謝通路代謝物總數相關代謝物個數 相關代謝物影響值苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成41酪氨酸0.5甲烷代謝91絲氨酸0.4酪氨酸代謝442酪氨酸、多巴胺0.3組氨酸代謝151組氨酸0.2甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝313蘇氨酸、絲氨酸、肌酸0.2苯丙氨酸代謝112酪氨酸、苯乙胺0.2甘油磷脂代謝301磷脂酰膽堿0.1氨?；?tRNA生物合成695酪氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、絲氨酸、組氨酸0.1

圖2 使用MetPA數據庫構建重要內源性小分子相關代謝通路Figure 2 Construction of important endogenous small molecule-related metabolic pathways using the MetPA database

3 討論

α-核突觸蛋白(α-synuclein)是一種在中樞神經系統(tǒng)突觸前及核周表達、正常生理狀態(tài)下呈天然的未折疊的可溶性蛋白[9]。有研究顯示,α-核突觸蛋白的基因突變會導致罕見的家族型帕金森病(Parkinson disease,PD)的發(fā)生,其產生的毒性作用最終會引起多巴胺神經元的凋亡[10-12],進而引起帕金森的發(fā)生。但鑒于機體內生物分子網絡之間關系的復雜性,α-核突觸蛋白的變異會影響體內多個生物靶點以及這些靶點關聯的組織器官的功能。明確α-核突觸蛋白相關靶點所構成的生物分子網絡有助于全面解析其在機體內的生物功能,從而為利用該分子靶點構建機制明確的病理模型或開發(fā)針對該靶點的有效治療藥物。代謝組學是近年發(fā)展起來的對機體內源性小分子物質的整體及其動態(tài)變化規(guī)律的檢測分析的一門新技術,其研究的是特定的生物體系受到干預后產生的內源性代謝變化,可以對那些能描述代謝循環(huán)情況的關鍵化合物進行定性和定量分析,進而明確該生物復雜系統(tǒng)中所有組成成分的構成及在特定條件下這些組分之間的相互關系[7,8]。目前最常用的分離分析手段包括氣相色譜、液相聯用質譜及核磁共振技術以及質譜聯用液相色譜。

本研究利用液質聯用技術,以肝臟組織為研究對象,對α-核突觸蛋白轉基因模式動物小鼠的內源性代謝產物進行了檢測,采用主成分、聚類分析等化學計量學方法進行了深入挖掘。研究發(fā)現,α-核突觸蛋白變異后,苯丙氨酸、絡氨酸和色氨酸生物合成,苯丙氨酸代謝,甲氨酸代謝,絡氨酸代謝,組氨酸代謝,甘油磷脂代謝,氨酰tRNA生物合成等代謝通路受到了顯著影響,其中涉及絡氨酸、絲氨酸、肌酸、多巴胺、組氨酸、苯乙胺、磷脂酰膽堿、蘇氨酸、丙氨酸等標志性代謝產物的生物學變化。其中,多巴胺和苯乙胺表達上調。多巴胺是遍布整個大腦的信號分子,在調節(jié)情緒和控制運動方面起到重要作用,與帕金森氏癥、抑郁癥和精神分裂癥等有關。同時多巴胺也是合成去甲腎上腺素及腎上腺素的前體物,主要表現為外周作用,具有興奮腎上腺素α、β受體的作用,但對β2受體作用較弱;同時也作用于腎臟和腸系膜血管、冠狀動脈的多巴胺受體,但其末梢作用較復雜。肝臟作為腹腔內不成對臟器靜脈血的“收集器”,其多巴胺水平的高低能夠反映機體外周血液中的含量。目前醫(yī)學界認為帕金森癥是由于多巴胺能神經元受損,多巴胺分泌不足,不能持續(xù)地分泌多巴胺,從而出現了運動障礙所致[13-15]。而本研究發(fā)現α-核突觸蛋白變異后小鼠肝組織中多巴胺水平增高,其可能的機制與α-核突觸蛋白變異后中樞多巴胺合成或分泌不足導致的外周多巴胺的代償性合成增多有關。值得關注的是,多巴胺水平增高會進一步提高腎上腺素的合成,進而引起心血管等的生物學功能變化。本研究中苯丙氨酸和苯乙胺同時增高,與苯乙胺(phenethylamine,PEA)是苯丙氨酸在腦中通過脫羧作用而生成的研究報道相吻合。苯乙胺能誘導兒茶酚胺受體生成,是一種單胺類神經遞質或神經調解劑,具有提升細胞外液中多巴胺水平的作用[16,17],肝臟組織中多巴胺含量的升高可能與苯乙胺的上調具有一定的因果關系。本研究首次明確了小鼠α-核突觸蛋白變異對于肝臟代謝的影響,因為帕金森病為全身性疾病,所以對于進一步明確帕金森病的病理機制具有一定的意義。