暴 鵬,李 雪,孫麗莎,張曉冉,楊欣怡,李朝敏

(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,成都 610075;*通訊作者,E-mail:Chenyi2006@163.com)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy,DPN)指在無其他疾病影響下,糖尿病患者發(fā)生與周圍神經(jīng)功能病變相關(guān)的臨床癥狀和(或)體征,可導(dǎo)致患者感覺、運動以及自主神經(jīng)功能異常,其中以感覺神經(jīng)功能障礙最為嚴(yán)重[1],患者多表現(xiàn)為雙側(cè)肢體感覺功能異常,嚴(yán)重者甚至可導(dǎo)致肢體肌肉萎縮[2]。目前,DPN的發(fā)病機制尚未明確,尚缺乏針對性治療方式。劉劍鋼等[3]給予DPN患者補陽還五湯治療,并且與西醫(yī)常規(guī)治療為對照組,研究結(jié)果表明中藥方劑治療效果明顯優(yōu)于對照組,且能夠改善患者血液黏滯狀態(tài),提高患者脂質(zhì)代謝功能,改善周圍神經(jīng)組織缺血缺氧狀態(tài),提高神經(jīng)信號傳導(dǎo)。薛鑄等[4]采用黃芪桂枝五物湯治療DPN患者,結(jié)果表明能夠有效提高DPN患者的腓總神經(jīng)傳導(dǎo)。尚無溫陽固本湯治療DPN的相關(guān)報道。本研究探討溫陽固本湯對DPN大鼠NGF及BDNF表達(dá)、脂代謝和坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的影響,明確該方劑對DPN的保護作用及作用機制,為中醫(yī)藥治療DPN提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

5-6周齡SPF級雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量180-220 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(生產(chǎn)許可證:北京百善SCXK(京)2016-0006),飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實驗中心(設(shè)施使用許可證號:SCXK(川)2008-Ⅱ),溫度18-26 ℃,相對濕度40%-70%。

1.2 溫陽固本湯

溫陽固本湯方劑為仙靈脾15 g、黃芪15 g、半枝蓮15 g、丹參15 g、茯苓15 g、大黃(熟)10 g,白術(shù)10 g、制附子6 g、蘇葉為6 g、熟地3 g、甘草3 g,由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供,水煎濃縮為生藥量1.5 g/ml,分裝后4 ℃保存?zhèn)溆?按各組所需濃度稀釋后用于SD大鼠灌胃。

1.3 主要試劑

鏈脲霉素(STZ)購自華中海威(北京)基因科技有限公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自碧云天生物技術(shù)有限公司,sc-2048 ECL試劑盒購自美國Santa cruz公司,NGF為兔來源的多克隆抗體(美國GeneTex公司),M-MLU反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國thermoscientific公司),real-time PCR擴增試劑盒購自上海索寶生物科技有限公司,BDNF為兔來源的多克隆抗體購自杭州華安生物技術(shù)有限公司,M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自solarbio公司,甘油三酯(TG)試劑盒、膽固醇(TC)試劑盒、高密度脂蛋白(HDL-C)試劑盒和低密度脂蛋白(LDL-C)試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。

1.4 糖尿病大鼠模型制備

隨機選取10只大鼠為對照組,其余50只大鼠禁食12 h,腹腔注射檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.2)配制的濃度為2%的鏈脲佐菌素(STZ)溶液,按60 mg/kg劑量腹腔注射;對照組大鼠腹腔注射等量檸檬酸鹽緩沖液,腹腔注射造模后72 h,測定大鼠尾尖靜脈血血糖,以多次隨機尾尖血糖值不低于16.7 mmol/L為糖尿病大鼠模型造模成功標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.5 DPN大鼠模型制備

糖尿病大鼠繼續(xù)飼喂維持期飼料4周,腹腔注射10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)麻醉大鼠,仰臥位固定。消毒備皮,沿右側(cè)腹股溝作為2 cm長切口,鈍性分離肌肉、血管,用動脈夾在腹股溝處夾閉股動脈;再于腹壁正中線作3 cm長切口,鈍性分離肌肉、血管,于髂總動脈右側(cè)分支約1 cm處夾閉血管,于髂腰動脈水平下約0.5 cm夾閉腹主動脈。無菌生理鹽水紗布覆蓋傷口,采用紅外燈維持大鼠右后肢環(huán)境溫度為35 ℃。術(shù)后第4天恢復(fù)右后肢血液供應(yīng),逐層縫合肌肉組織和皮膚。無菌輔料覆蓋傷口且注意保持輔料清潔。術(shù)后連續(xù)3 d每只大鼠腹腔注射8萬U/d青霉素預(yù)防感染。

1.6 分組與處理

手術(shù)造模后7 d,待大鼠傷口基本愈合后給予藥物治療。50只DPN模型大鼠隨機分為模型組、陽性對照組、溫陽固本湯低劑量組、溫陽固本湯中劑量組及溫陽固本湯高劑量組,每組10只。參考徐叔云教授主編《藥理實驗方法學(xué)》,溫陽固本湯低、中、高劑量組按照成人劑量的6.25倍、12.5倍、25倍分別給予溫陽固本湯9.17 g/kg、18.33 g/kg及36.67 g/kg灌胃,陽性對照組20 mg/kg α-硫辛酸灌胃,對照組和模型組等量生理鹽水灌胃,1次/d,連續(xù)56 d。

1.7 血脂檢測

灌胃8周后,10%水合氯醛按0.4 ml/100 g劑量腹腔注射麻醉大鼠,腹主動脈采血5 ml于含有7.5% EDTA的真空采血管中,4 ℃ 3 000 r/min離心10 min,分離血漿置于-80 ℃?zhèn)溆?。血漿指標(biāo)均嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測。

1.8 坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)觀察

取血后取大鼠右側(cè)后肢坐骨神經(jīng)約0.5 cm,放入2.5%戊二醛固定,隨后再使用四氧化鋨染色、環(huán)氧樹脂包埋、切片,行電子透射顯微鏡觀察。

1.9 坐骨神經(jīng)NGF、BDNF檢測

取大鼠后肢坐骨神經(jīng)置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

NGF、BDNF表達(dá)水平檢測:將大鼠右側(cè)后肢坐骨神經(jīng)從液氮中取出約0.5 cm,采用免疫組化法檢測大鼠坐骨神經(jīng)中NGF、BDNF表達(dá)水平的檢測,操作過程均嚴(yán)格按照免疫組化法說明書操作要求。

NGF、BDNF的mRNA水平檢測：將大鼠右側(cè)后肢坐骨神經(jīng)從液氮中取出，放入預(yù)冷的研缽中加入液氮進(jìn)行快速研磨，然后將粉末裝入預(yù)冷的EP管中，每管加入1 ml Trizol，用槍吹打數(shù)次，室溫放置5 min。取提取的總RNA 2 μl逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為3 μl RNA、1 μl Oligo(dT)、9.5 μl ddH2O，反應(yīng)體系先于70 ℃孵育5 min，0 ℃冰水浴后離心加入5 μl 5XBuffer、5 μl dNTP(10 mmol/L)、0.5 μl(Ribonuclease inhibitor)及1 μl M-MLV RT混合液，離心混勻先42 ℃孵育60 min，后70 ℃孵育10 min；冰上分裝，-20 ℃保存cDNA。采用合成的cDNA第一條鏈為模板進(jìn)行PCR，NGF、BDNF反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，2 min，(94 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s；72 ℃ 10 min)40個循環(huán)，設(shè)立無模板對照和RT陰性對照。

NGF上游引物:5′-CACTCTGAGGTGCATAGCGT-3′,下游引物:5′-GCTTCAGGGACAGAGTCTCC-3′。BDNF上游引物:5′-CTGGATGAGGACCAGAAGGT-3′,下游引物:5′-CAGAAAGAGCAGAGGAGGCT-3′。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果

對照組SD大鼠無死亡,DPN模型大鼠死亡4只,即模型組死亡3只,溫陽固本湯低劑量組死亡1只,模型大鼠符合要求者進(jìn)入實驗組,排除RNA提取不合格者,則最終對照組大鼠10只,模型組大鼠6只,溫陽固本湯低劑量組8只,溫陽固本湯中劑量組10只,溫陽固本湯高劑量組9只。

2.2 大鼠血漿TG、TC、LDL-C、HDL-C含量

模型組大鼠血漿TG、TC、LDL-C含量明顯高于對照組,HDL-C低于對照組(P<0.01);溫陽固本湯中、高組血清TG、TC、LDL-C、HDL-C含量均明顯低于模型組(P<0.01);溫陽固本湯低劑量組TG、LDL-C、HDL-C含量均明顯低于模型組(P<0.01);溫陽固本湯低劑量組TC含量低于模型組(P<0.05,見表1)。

表1 大鼠血漿TG、TC、LDL-C、HDL-C含量(mmol/L)

Table 1 Contents of plasma TG, TC, LDL-C and HDL-C in rats after different treatment(mmol/L)

組別TGTCLDL-CHDL-C對照組0.35±0.071.61±0.220.52±0.171.92±0.05模型組2.73±0.85??4.31±2.04??2.77±0.83??0.68±0.08??陽性對照組0.88±0.46##3.48±0.621.06±0.43##1.58±0.16##溫陽固本湯低劑量組0.95±0.56##3.01±0.75#1.21±0.52##1.27±0.12##溫陽固本湯中劑量組0.86±0.45##2.14±0.22##0.81±0.15##1.12±0.12##溫陽固本湯高劑量組0.80±0.12##2.13±0.12##0.60±0.22##1.04±0.09##

與對照組對比,**P<0.01;與模型組對比,#P<0.05,##P<0.01

2.3 大鼠神經(jīng)NGF、BDNF的表達(dá)結(jié)果

與對照組對比,模型組NGF、BDNF表達(dá)水平明顯降低(P<0.01);陽性對照組NGF水平高于模型組(P<0.05),BDNF水平顯著高于模型組(P<0.01);溫陽固本湯低劑量組BDNF水平顯著高于模型組(P<0.01,見表2);溫陽固本湯中、高劑量組NGF、BDNF表達(dá)水平明顯高于模型組,且隨劑量的增加表達(dá)水平不斷升高(見圖1,2)。

表2 大鼠坐骨神經(jīng)NGF、BDNF的表達(dá)結(jié)果

Table 2 NGF and BDNF expression in sciatic nerves of rats

分組NGF平均光密度值BDNF平均光密度值對照組 99.73±10.61 126.60±28.66模型組 71.00±2.57?? 29.70±11.14??陽性對照組 94.90±22.77# 69.35±15.87##溫陽固本湯低劑量組 63.94±7.18 79.46±16.95##溫陽固本湯中劑量組107.32±18.00## 94.94±3.74##溫陽固本湯高劑量組101.28±13.84## 101.93±7.22##

與對照組對比,**P<0.01;與模型組對比,#P<0.05,##P<0.01

A.對照組;B.模型組;C.陽性對照組;D.低劑量組;E.中劑量組;F.高劑量組圖1 大鼠神經(jīng)NGF的表達(dá)結(jié)果 (×400)Figure 1 NGF expression in sciatic nerves of rats by immunohistochemical staining under light microscopy (×400)

2.4 大鼠坐骨神經(jīng)組織NGF mRNA、BDNF mRNA相對水平

模型組坐骨神經(jīng)組織NGF mRNA、BDNF mRNA相對水平明顯低于對照組(P<0.01);陽性對照組NGF mRNA表達(dá)水平高于模型組(P<0.05),BDNF mRNA明顯高于模型組(P<0.01);溫陽固本湯低、中、高劑量組NGF mRNA、BDNF mRNA相對水平均明顯高于模型組(P<0.01,見表3)。

表3 大鼠坐骨神經(jīng)組織NGF、BDNF mRNA的相對水平

Table 3 The mRNA expression of NGF and BDNF in sciatic nerve tissue of rats

分組?NGF mRNABDNF mRNA對照組1.17±0.230.91±0.19模型組0.20±0.08??0.22±0.07??陽性對照組0.48±0.20#0.48±0.13##溫陽固本湯低劑量組0.63±0.29##0.56±0.09##溫陽固本湯中劑量組0.99±0.29##0.81±0.12##溫陽固本湯高劑量組0.85±0.27##0.61±0.15##

與對照組對比,**P<0.01;與模型組對比,#P<0.05,##P<0.01

2.5 大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)變化

正常組大鼠坐骨神經(jīng)橫切面圖片顯示神經(jīng)髓鞘結(jié)果致密、完整、均勻,且呈現(xiàn)同心圓樣明暗相間的板層結(jié)構(gòu),施萬細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,核大圓潤,軸索內(nèi)可見大量神經(jīng)絲、微絲、微管及線粒體,各結(jié)構(gòu)完整、排列規(guī)則(見圖3A);模型組大鼠坐骨神經(jīng)橫切面圖片顯示神經(jīng)髓鞘板層結(jié)構(gòu)分離,各層間排列雜亂,層間可見大量空泡及裂隙,神經(jīng)軸索萎縮,線粒體結(jié)構(gòu)紊亂,施萬細(xì)胞變性壞死(見圖3B);陽性對照組大鼠坐骨神經(jīng)橫切面圖片顯示神經(jīng)髓鞘空泡及裂隙數(shù)目降低,但板層結(jié)構(gòu)紊亂未緩解,線粒體結(jié)構(gòu)無恢復(fù),鏡下無正常施萬細(xì)胞(見圖3C);溫陽固本湯低劑量組和中劑量組大鼠坐骨神經(jīng)橫切面圖片顯示神經(jīng)髓鞘空泡及裂隙數(shù)目明顯減少,髓鞘板層結(jié)構(gòu)未恢復(fù),鏡下可見結(jié)構(gòu)正常的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及施萬細(xì)胞(見圖3D、E);溫陽固本湯高劑量組神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常,且呈現(xiàn)同心圓樣明暗相間的板層結(jié)構(gòu),鏡下髓鞘空泡及裂隙較少,僅小部分線粒體、微絲、微管結(jié)構(gòu)異常,施萬細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整(見圖3F)。

A.對照組;B.模型組;C.陽性對照組;D.低劑量組;E.中劑量組;F.高劑量組圖3 大鼠神經(jīng)組織超微結(jié)構(gòu) (×8 000)Figure 3 Ultrastructure of nerve tissues in rats (×8 000)

3 討論

DPN為糖尿病患者最為多見的慢性并發(fā)癥之一,在糖尿病患者中具有較高的發(fā)病率和致殘率?！吨袊悄虿∩窠?jīng)病變診療規(guī)范》(2009年)表明:確診為糖尿病的患者在其10年病程中,神經(jīng)系統(tǒng)可隨病程的不斷增加出現(xiàn)不同程度的病變[6],對糖尿病患者的生活質(zhì)量及預(yù)后造成嚴(yán)重危害。因此,尋找有效的防治措施對DPN患者或高?；颊呔哂兄匾獌r值,也是現(xiàn)階段內(nèi)分泌領(lǐng)域研究的熱點問題。

高血糖為DPN發(fā)生的核心環(huán)節(jié),但對其發(fā)病機制尚未明確,研究認(rèn)為DPN與糖脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激、神經(jīng)因子缺乏及免疫功能異常等因素有關(guān)。美國糖尿病協(xié)會(American Diabetes Association,ADA)(2001年)大會McGarry提出DPN發(fā)病的“脂毒性”學(xué)說,該學(xué)說認(rèn)為脂代謝異常是導(dǎo)致糖尿病及其并發(fā)癥病理生理學(xué)改變的主要原因[7]。本研究結(jié)果表明,模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C含量明顯高于對照組,HDL-C低于對照組(P<0.01);溫陽固本湯中、高組血清TG、TC、LDL-C、HDL-C含量均明顯低于模型組(P<0.01);溫陽固本湯低劑量組TG、LDL-C、HDL-C含量均明顯低于模型組(P<0.01);溫陽固本湯低劑量組TC含量低于模型組(P<0.05)。結(jié)果表明神經(jīng)組織發(fā)生脂代謝異常時,對神經(jīng)細(xì)胞及其結(jié)構(gòu)和功能可能造成直接或間接影響。與對照組相比,模型組大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞的髓鞘、軸索均出現(xiàn)損傷,溫陽固本湯各劑量組對髓鞘、軸索均有修復(fù)作用,但以高劑量組效果最好。有研究發(fā)現(xiàn),高脂血癥可導(dǎo)致機體細(xì)胞變性和促進(jìn)血小板聚集,降低血液流速,從而導(dǎo)致微血管血栓的形成,引起神經(jīng)細(xì)胞供血、供氧障礙,從而對神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能造成直接破壞[8]。大量研究發(fā)現(xiàn),機體脂代謝功能紊亂,脂質(zhì)過氧化物水平升高,從而促進(jìn)ROS的大量產(chǎn)生,引起機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)。神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)膜氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS對神經(jīng)組織具有直接損傷作用;ROS為一種氧化應(yīng)激信號分子,ROS水平異?？纱碳ぜ?xì)胞內(nèi)一系列氧化應(yīng)激信號通路的激活,從而通過直接或間接作用,引起神經(jīng)細(xì)胞的功能異常、微循環(huán)障礙等,使神經(jīng)細(xì)胞或組織功能受損及缺乏營養(yǎng)支持引起神經(jīng)細(xì)胞的壞死或凋亡,從而導(dǎo)致DPN[9-12]。Cameron等[13]研究發(fā)現(xiàn),糖尿病患者血漿中LDL-C可被AGES修飾,形成為晚期糖基化終產(chǎn)物修飾的低密度脂蛋白(advance glycation end product of low density lipoprotein,AGE-LDL),AGE-LDL被吞噬細(xì)胞吞噬后可于血管壁聚集,并相互交聯(lián)形成為分子量更大的AGEs,促進(jìn)血管病變的進(jìn)展。Tesfaye等[14]研究發(fā)現(xiàn),糖化血紅蛋白和LDL-C長期持續(xù)處于高水平狀態(tài),可導(dǎo)致糖尿病患者DPN發(fā)病率增加,提前發(fā)病時間。

NGF和BDNF為神經(jīng)營養(yǎng)因子。NGF為多肽類物質(zhì),主要分布于交感神經(jīng)元和部分感覺神經(jīng)元分布的區(qū)域內(nèi)的組織細(xì)胞,具有維持交感和感覺神經(jīng)功能的作用;BDNF為腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子,該因子主要由神經(jīng)元細(xì)胞合成分泌,對神經(jīng)細(xì)胞的分化、生長及維持神經(jīng)元功能具有重要作用。Kobayashi等[15]對糖尿病患者血漿中樞神經(jīng)營養(yǎng)因子特別是NGF研究發(fā)現(xiàn),NGF缺乏為DPN發(fā)生的主要危險因素之一。高妍等[16]對糖尿病患者應(yīng)用鼠神經(jīng)生長因子聯(lián)合胰島素泵后血清Cys-C水平變化研究發(fā)現(xiàn),NGF對周圍神經(jīng)具有顯著的保護作用,且對感覺神經(jīng)也具有較好的營養(yǎng)作用。Nitta等[17]和呂翠巖等[18]研究發(fā)現(xiàn),糖尿病大鼠腦組織及坐骨神經(jīng)中BDNF mRNA表達(dá)水平降低,同時還發(fā)現(xiàn)該因子受體和促進(jìn)該因子分泌的NGF mRNA表達(dá)水平顯著降低。Li等[19]對糖尿病大鼠進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)給予外源性BDNF能夠有效降低體質(zhì)量和血糖水平。沈祥峰等[20]對糖尿病大鼠給予不同濃度的運脾和絡(luò)顆粒灌胃干預(yù),結(jié)果表明高糖條件下周圍神經(jīng)組織中的BDNF表達(dá)水平降低,使得受損神經(jīng)纖維的修復(fù)明顯減緩。本研究采用免疫組織化學(xué)法和real-time PCR法檢測大鼠坐骨神經(jīng)組織中NGF、BDNF、NGF mRNA和BDNF mRNA的表達(dá)水平,研究結(jié)果表明,大鼠坐骨神經(jīng)組織中的NGF、BDNF、NGF mRNA和BDNF mRNA表達(dá)水平均存在顯著降低,中藥方劑溫陽固本湯能夠有效提高DPN大鼠NGF、BDNF、NGF mRNA和BDNF mRNA的表達(dá)。由此說明,中藥方劑溫陽固本湯對DPN的保護作用可能與促進(jìn)NGF、BDNF、NGF mRNA和BDNF mRNA的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述,中藥方劑溫陽固本湯可降低DPN大鼠血脂水平,促進(jìn)NGF、BDNF、NGF mRNA和BDNF mRNA的表達(dá),該方劑對糖尿病周圍神經(jīng)的保護作用可能是通過降低血脂水平,增加NGF、BDNF、NGF mRNA和BDNF mRNA表達(dá)量有關(guān)。