不同產(chǎn)地艾葉紅外指紋圖譜研究

李超 姬鵬鵬 黃顯章

摘要：為了建立不同產(chǎn)地艾葉藥材的紅外指紋圖譜，為艾葉產(chǎn)地鑒別提供新的技術(shù)和方法，采用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)對(duì)國(guó)內(nèi)6個(gè)主產(chǎn)地的艾葉樣品進(jìn)行分析，通過圖譜的表征解析、相似度對(duì)比、主成分分析及聚類分析等方法，建立艾葉紅外指紋圖譜并探討鑒別不同產(chǎn)地艾葉的方法。結(jié)果表明：不同產(chǎn)地艾葉的紅外圖譜相似度較高，但運(yùn)用適當(dāng)?shù)挠?jì)量學(xué)方法可實(shí)現(xiàn)艾葉的產(chǎn)地鑒別;紅外圖譜解析、相關(guān)系數(shù)分析及聚類分析等方法可對(duì)不同產(chǎn)地艾葉樣品進(jìn)行正確的分類，結(jié)果相互驗(yàn)證和補(bǔ)充?？梢?，紅外指紋圖譜分析技術(shù)適用于艾葉的產(chǎn)地鑒別，該結(jié)果為艾葉的產(chǎn)地溯源和質(zhì)量控制提供了一種新的思路。

關(guān)鍵詞：艾葉;不同產(chǎn)地;紅外指紋圖譜;相關(guān)系數(shù);聚類分析

中圖分類號(hào)：R284.1 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）17-0222-03

艾葉為菊科多年生草本植物艾（Artemisia argyi Levl.et Vant.）的干燥葉[1]，性溫，味苦，歸肝經(jīng)、脾經(jīng)、腎經(jīng)，具有散寒止痛、溫經(jīng)止血、補(bǔ)氣安胎、止咳平喘等功效，是中醫(yī)婦科常用中藥之一[2]。艾葉于夏季花未開時(shí)采摘，除極干旱和高寒地區(qū)外，在我國(guó)大部分地區(qū)均有分布，主要分布于湖北、浙江、安徽、河南、河北等省份，并在局部植物群落中呈現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)種群。

近年來(lái)，艾產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展帶來(lái)了艾葉資源需求的激增，但同時(shí)也存在諸多安全隱患，艾葉產(chǎn)地難以溯源及艾葉品質(zhì)參差不齊已成為制約艾產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要瓶頸。前人雖對(duì)不同產(chǎn)地艾葉的品質(zhì)評(píng)價(jià)做了大量的研究工作，為艾葉產(chǎn)地間的差異研究提供了有益的本底材料[3-5]，但前人研究方法具有操作復(fù)雜、預(yù)處理繁瑣、試驗(yàn)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。因此，一種操作簡(jiǎn)單、快捷準(zhǔn)確的試驗(yàn)方法亟待開發(fā)。

中藥材紅外光譜具有“指紋性”，借助紅外特征吸收的差異可達(dá)到區(qū)分和鑒別中藥材的目的，且該技術(shù)具有無(wú)損、快捷等顯著的優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于多種中藥材的產(chǎn)地鑒別[6-11]，但不同產(chǎn)地艾葉藥材的紅外光譜研究尚未開展。因此，本試驗(yàn)以6個(gè)不同主產(chǎn)區(qū)的艾葉樣品為研究對(duì)象，建立艾葉紅外指紋圖譜，挖掘指紋譜圖中的潛在差異信息，并結(jié)合相似度評(píng)價(jià)及化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，最終對(duì)艾葉藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。本研究為艾葉藥材的質(zhì)量控制及產(chǎn)地鑒別提供一種新的技術(shù)和方法。

1 材料與方法

1.1 材料收集

2017年5—6月，從河北安國(guó)、浙江寧波、湖北蘄春、山東煙臺(tái)、河南湯陰及河南西峽采集野生狀態(tài)的艾葉樣品，經(jīng)南陽(yáng)理工學(xué)院中藥教研室黃顯章副教授鑒定為艾的干燥葉。將艾葉樣品去雜、清洗、自然干燥、粉碎、過篩，混勻后備用。

1.2 儀器與試劑

傅里葉變換紅外光譜儀（自帶DTGS檢測(cè)器，TENSOR 27型，德國(guó)Bruker公司）;分析天平（FA-2204B，上海精密科學(xué)儀器有限公司）;萬(wàn)能粉碎機(jī)（FW-135型，天津泰斯特儀器有限公司）;粉末壓片機(jī)（FY-15型，上海天闔機(jī)械設(shè)備有限公司）;紅外干燥箱（8401-2A型，常州諾基儀器有限公司）;KBr（光譜純，南京化學(xué)試劑公司）。

1.3 試驗(yàn)環(huán)境及方法

1.3.1 試驗(yàn)環(huán)境 不同產(chǎn)地艾葉紅外圖譜的測(cè)定在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測(cè)試中心完成，分析過程中溫度保持在22～27 ℃，空氣濕度保持在30%～40%，每個(gè)艾葉粉末壓片累積掃描次數(shù)32次，每次掃描時(shí)均扣除H2O和CO2的干擾。

1.3.2 試驗(yàn)方法 稱取艾葉粉末樣品1.0 mg，于瑪瑙研缽內(nèi)與KBr研磨充分（比例約為1 ∶ 200），并壓制成厚度約為1 mm 的透明錠片，放入傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定。每個(gè)產(chǎn)地均以溴化鉀為背景，制備3個(gè)艾葉粉末樣品片，每個(gè)樣品片隨機(jī)掃描3個(gè)不同的位置，獲得3張紅外光譜圖，取計(jì)算后的平均譜圖作為最終的艾葉譜圖。

1.3.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)預(yù)處理 將得到的不同產(chǎn)地艾葉原始紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行多點(diǎn)基線校正，除去基線影響;進(jìn)行自動(dòng)多點(diǎn)平滑處理，去除噪聲;進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)歸一化處理，消除樣本間稱量的差異;借助SPSS 20.0分析軟件選取指紋區(qū)域1 300～500-1 cm 進(jìn)行主成分分析、因子分析及聚類分析等;應(yīng)用Origin和Omnic軟件拾取特征峰和繪制分析圖譜，借助SPSS和 SIMCA-P 軟件進(jìn)行計(jì)量學(xué)分析。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 精密度試驗(yàn) 稱取同一艾葉樣品，參照“2.3.2”節(jié)中試驗(yàn)方法，連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算其共有峰波數(shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差。

1.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取同一艾葉樣品，參照“2.3.2”節(jié)中試驗(yàn)方法，分別于0、2、4、8、24 h測(cè)定，計(jì)算其共有峰波數(shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差。

1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一艾葉樣品，稱取5份平行樣，參照“1.3.2”節(jié)中的試驗(yàn)方法，計(jì)算共有峰波數(shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，共有峰波數(shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差在 0.08%～2.95%之間，24 h內(nèi)樣品穩(wěn)定;精密度試驗(yàn)表明，共有峰波數(shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均小于0.13%;重復(fù)性試驗(yàn)表明，共有峰波數(shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差在0.11%～4.55%，說(shuō)明該方法可靠、重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，符合指紋圖譜的要求。

2.2 對(duì)照紅外指紋圖譜

本試驗(yàn)以共有模式建立艾葉對(duì)照紅外指紋圖譜，選擇道地產(chǎn)區(qū)（蘄艾）并且經(jīng)傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒定品質(zhì)較好的10批次蘄艾樣品作為對(duì)照藥材，取其平均光譜為對(duì)照譜圖。每份蘄艾樣品選取不同位置隨機(jī)掃描3次，以吸收強(qiáng)度均值作為紅外對(duì)照?qǐng)D譜的吸收強(qiáng)度，對(duì)照紅外圖譜見圖1。

2.3 對(duì)照紅外圖譜解析及表征

在得到的對(duì)照?qǐng)D譜（圖1）中，3 411 cm-1附近頻率低，譜帶寬的吸收峰可能為N—H及O—H的伸縮振動(dòng)峰;2 918 cm-1 附近的吸收峰可能為C—H伸縮振動(dòng)峰;1 638 cm-1 處附近的吸收峰可能為CO或CC的伸縮振動(dòng)峰;1 398 cm-1 處的吸收峰可能為C—O伸縮振動(dòng)峰;1 262 cm-1 處的吸收峰可能為取代苯類C—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰;1 058 cm-1處可能為苷類，多糖類等碳水化合物的C—O彎曲振動(dòng);616 cm-1處可能為C—H的面外彎曲振動(dòng)峰。

2.4 艾葉紅外指紋圖譜的相似度分析

本試驗(yàn)采用共有特征峰及全譜相似度分析相結(jié)合的方法，這樣既能突出共有峰的特點(diǎn)，又能將全譜信息強(qiáng)度和位置差異體現(xiàn)出來(lái)，分析方法較為全面和準(zhǔn)確，提高了樣品間的可比性和比較的精度。

2.4.1 艾葉紅外指紋圖譜共有特征峰的相似度分析 經(jīng)過對(duì)不同產(chǎn)地艾葉樣品進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)共有特征峰為616、1 058、1 262、1 398、1 638、2 918、3 411 cm-1，其編號(hào)分別為1、2、3、4、5、6。從不同產(chǎn)地艾葉樣品的共有特征峰與蘄艾對(duì)照紅外圖譜的相似度分析結(jié)果（表1）可以看出，不同產(chǎn)地艾葉樣品紅外圖譜的共有特征峰相關(guān)系數(shù)可分為2類。第1類為河南湯陰所產(chǎn)艾葉，該產(chǎn)區(qū)艾葉的相關(guān)系數(shù)在0.99以上，與道地產(chǎn)區(qū)蘄艾的相似度較高;第2類主要包括河北安國(guó)、山東煙臺(tái)、河南湯陰、浙江寧波，以上產(chǎn)區(qū)艾葉的相關(guān)系數(shù)在0-8～0.9之間。

2.4.2 艾葉FTIR指紋圖譜全波段的相似度分析 從不同產(chǎn)地艾葉樣品的全波段圖譜與蘄艾對(duì)照紅外圖譜的相似度分析結(jié)果（表1）可以看出，不同產(chǎn)地艾葉樣品紅外圖譜的全波段相關(guān)系數(shù)可分為2類。第1類為河南湯陰所產(chǎn)艾葉，該產(chǎn)區(qū)艾葉的相關(guān)系數(shù)在0.990以上，與道地產(chǎn)區(qū)蘄艾的相似度較高;第2類主要包括河北安國(guó)、山東煙臺(tái)、河南西峽、浙江寧波，以上產(chǎn)區(qū)艾葉的相關(guān)系數(shù)在0.950～0.990，仍具有較高的相似性。

2.5 艾葉紅外指紋圖譜主成分分析

選取波段 1 300～500 cm-1 作為不同產(chǎn)地艾葉的“指紋區(qū)”進(jìn)行分析，并建立基于主成分分析的模型，表2為不同產(chǎn)地艾葉紅外圖譜的特征向量值及累計(jì)貢獻(xiàn)率。從表2可以看出，所提取的前5主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率已經(jīng)高達(dá)99.99%，可以替代原始的FTIR圖譜。

從圖2可看出，不同產(chǎn)地艾葉紅外光譜在散點(diǎn)圖上的位置關(guān)系與其光譜的相似度相吻合，如河南湯陰艾葉與湖北蘄春艾葉相似度較高（相關(guān)系數(shù)在0.990以上），則在主成分散點(diǎn)圖上均分布于第二象限;河南西峽艾葉和浙江寧波艾葉與道地產(chǎn)區(qū)湖北蘄春相似度較低，則在散點(diǎn)圖上分布第四象限，與湖北蘄春艾葉距離較遠(yuǎn);同理，河北安國(guó)所產(chǎn)艾葉和山東煙臺(tái)所產(chǎn)艾葉與道地產(chǎn)區(qū)湖北蘄春相似度居中，則分別分布于第一象限和第三象限。

2.6 不同產(chǎn)地艾葉指紋圖譜聚類分析

艾葉紅外圖譜在距離系數(shù)為5時(shí)， 可將不同產(chǎn)地艾葉樣品劃分為3個(gè)表征群（圖3），其中山東煙臺(tái)和河南西峽的艾葉樣品、湖北蘄春和河南湯陰的艾葉樣品首先聚為一類，這與圖2的主成分散點(diǎn)圖分布象限相吻合; 河北安國(guó)和浙江寧波的艾葉樣品分別處于第二、第三表征群，說(shuō)明親緣關(guān)系和相似度匹配相對(duì)較遠(yuǎn)，這也與“2.4”節(jié)中部分分析結(jié)果吻合。

3 討論和結(jié)論

紅外光譜技術(shù)在中藥質(zhì)量控制和產(chǎn)地鑒別等研究領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛和深入，該技術(shù)具有無(wú)損、快捷等顯著的優(yōu)點(diǎn)，且操作簡(jiǎn)單快捷，檢測(cè)速度快，無(wú)需復(fù)雜預(yù)處理，較為適合實(shí)際生產(chǎn)。紅外光譜法僅需少量粉末樣品，收集4 000～400 cm-1光譜圖后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和信息挖掘即可得出鑒定結(jié)果，尤其是將紅外圖譜與相關(guān)系數(shù)法、偏最小二乘法、主成分分析法等計(jì)量學(xué)方法相結(jié)合，可以挖掘藥材原始光譜中潛在的地理信息，在中藥材產(chǎn)地鑒別和質(zhì)量監(jiān)控等方面起重要作用。

本試驗(yàn)在筆者所在課題組前期研究的基礎(chǔ)上構(gòu)建不同產(chǎn)地艾葉紅外指紋圖譜，通過適當(dāng)?shù)挠?jì)量學(xué)方法（相關(guān)系數(shù)法、主成分分析法、聚類分析法等）挖掘艾葉產(chǎn)地間的差異。在主成分分析中，河南湯陰艾葉與湖北蘄春艾葉相似度較高，在第一、第二散點(diǎn)圖上均分布于第二象限;河南西峽艾葉和浙江寧波艾葉與道地產(chǎn)區(qū)湖北蘄春相似度較低，在第一、第二散點(diǎn)圖上均分布于距離較遠(yuǎn)的第四象限;河北安國(guó)艾葉和山東煙臺(tái)艾葉與道地產(chǎn)區(qū)湖北蘄春相似度居中，則分別分布于第一象限和第三象限;在聚類分析中，山東煙臺(tái)和河南西峽的艾葉樣品、湖北蘄春和河南湯陰的艾葉樣品首先聚為一類，河北安國(guó)和浙江寧波的艾葉樣品分別處于第二、第三表征群，這也與主成分分析的結(jié)果相吻合。本研究結(jié)果與孔德鑫等研究不同產(chǎn)地紫金牛藥材的主成分分析模型結(jié)果[12]和韋記青等研究不同產(chǎn)地戰(zhàn)骨的聚類分析結(jié)果[13]相似。筆者推測(cè)同種不同產(chǎn)地的中藥材受特定生態(tài)環(huán)境的影響，在長(zhǎng)期生態(tài)適應(yīng)過程中，中藥材生長(zhǎng)所需的溫度、光照、土壤、水文等生態(tài)因素與其生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)唇齒相關(guān)，并附帶了地域信息的指紋特征，中藥材品質(zhì)的優(yōu)劣取決于活性成分，而活性成分的合成和積累與其產(chǎn)地環(huán)境密切相關(guān)，這種關(guān)系可以體現(xiàn)在紅外光譜的差異上;同時(shí)，筆者還發(fā)現(xiàn)河南湯陰艾葉與道地產(chǎn)區(qū)湖北蘄春艾葉相關(guān)系數(shù)較高，說(shuō)明該地區(qū)艾葉的品質(zhì)與道地產(chǎn)區(qū)相近;在主成分分析和聚類分析中，又將湖北蘄春和河南湯陰艾葉劃分為一類，試驗(yàn)結(jié)果與上述分析相吻合，充分說(shuō)明河南湯陰與湖北蘄春艾葉品質(zhì)相近，質(zhì)量較好，故筆者建議在艾葉資源需求量緊缺的情況下可將河南湯陰作為艾葉的另一優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)。

本研究首次采用FTIR技術(shù)對(duì)6個(gè)不同產(chǎn)地的艾葉樣品進(jìn)行測(cè)定和分析，建立了艾葉產(chǎn)地間紅外指紋圖譜的共有模式，并進(jìn)行了共有特征峰的解析表征;從紅外圖譜和共有特征峰2個(gè)方面進(jìn)行相似度分析，試驗(yàn)結(jié)果相互補(bǔ)充和印證;建立了艾葉紅外指紋圖譜的主成分和聚類分析方法，試驗(yàn)結(jié)果與相似度分析結(jié)果相吻合。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地艾葉紅外圖譜整體相似度較高，但也存在一定的差異，運(yùn)用適當(dāng)數(shù)據(jù)分析方法可將不同產(chǎn)地的艾葉正確分類，從而實(shí)現(xiàn)艾葉的產(chǎn)地鑒別，為艾葉的產(chǎn)地溯源和質(zhì)量控制提供新的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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