高敬華 李楠 郭士杰 姜學(xué)霞

摘? ?要：本文主要是研究了富灣銀礦微生物的多樣性，通過(guò)采集富灣銀礦土壤樣品，利用16S rRNA基因序列分析細(xì)菌基因文庫(kù)，通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析確定了該礦區(qū)的微生物群落組成。結(jié)果表明，富灣銀礦土壤的主要微生物群落包括變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和浮霉菌門（Planctomycetes）以及未分類的細(xì)菌類群，揭示了富灣銀礦的土壤中存在著豐富的細(xì)菌，這為探討微生物修復(fù)礦區(qū)土壤污染提供理論的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：礦區(qū)? 多樣性? 16S rRNA? 重金屬污染

中圖分類號(hào)：S154? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：1674-098X（2019）06（a）-0109-03

重金屬污染積累性強(qiáng)，具有不可逆性。我國(guó)金屬礦產(chǎn)資源豐厚，在礦山的開發(fā)、運(yùn)送和礦石的冶煉過(guò)程中出現(xiàn)的尾礦、尾渣、粉塵顆粒等固液氣體廢棄物危害了礦區(qū)周圍土壤和水體，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和周邊環(huán)境良性發(fā)展造成潛在性危害[1]。重金屬長(zhǎng)期積累會(huì)危害人的智力發(fā)展以及身體發(fā)育[2]。 生物修復(fù)技術(shù)治理礦區(qū)重金屬污染是關(guān)鍵技術(shù)，運(yùn)用微生物的生化反應(yīng)和代謝過(guò)程轉(zhuǎn)化和治理礦區(qū)重金屬污染，具備資金投入少、操作過(guò)程簡(jiǎn)單、沒(méi)有產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)，是目前研究該領(lǐng)域的熱點(diǎn)[3]。

廣東富灣銀礦位于廣東省佛山市高明區(qū)富灣鎮(zhèn)荷城街道東北部（華南褶皺系粵中凹陷內(nèi)三洲上古生代斷陷盆地的西北邊緣），北北東向恩平一從化斷裂帶與東西向高要一惠來(lái)構(gòu)造帶交匯部位[4-5]，面積約 2.83km2。銀礦比鄰高明富灣大學(xué)城，周邊村落居民群較多。高明礦產(chǎn)資源豐富，其中富灣銀礦蘊(yùn)藏量最大的金屬礦之，富灣銀礦曾因被擬定開采開發(fā)利用而引起公眾關(guān)注。

本研究以富灣銀礦已開采的地方土壤為研究對(duì)象進(jìn)行樣品采集，采用非培養(yǎng)的方法，直接提取土樣中微生物的基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增、連接和轉(zhuǎn)化構(gòu)建了該礦區(qū)16S rRNA基因克隆文庫(kù)，對(duì)礦區(qū)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行了研究，揭示了富灣銀礦重金屬污染與微生物之間的內(nèi)在聯(lián)系，為其他污染礦區(qū)土壤的微生物生態(tài)研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1? 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究選取廣東省佛山市高明區(qū)富灣銀礦區(qū)的土壤進(jìn)行采集。地理坐標(biāo)為：東徑 112°48′01″，北緯 23°00′00″，根據(jù)礦區(qū)面積大小、地勢(shì)情況和污染狀況進(jìn)行梅花形布點(diǎn)采樣，采取0～15cm土層混合土樣，四分法去掉多余土壤，裝入無(wú)菌袋中，貼上標(biāo)簽，立即帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 富灣銀礦細(xì)菌DNA提取

用強(qiáng)勁土壤DNA提取試劑盒提取菌種基因組的DNA，通用引物27F和1492R進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 測(cè)序與構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

基因擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送往上海美吉醫(yī)藥生物有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，共測(cè)定100條序列，將所得序列結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST檢索，同時(shí)下載與未知細(xì)菌同源性相對(duì)較高的序列，利用ClustalX比對(duì)分析， MEGA軟件的N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。確定樣品中的細(xì)菌群落多樣性，利用Microsoft Excel 2010繪制細(xì)菌組成分布情況。

2? 結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果共計(jì)得到序列100條，發(fā)現(xiàn)這些序列可以分為6大門類（圖2）：Proteobacteria（變形菌門）42%，其中Alphaproteobacteria（α-變形菌綱）21%、Betaproteobacteria（β-變形菌綱）6%、Gammaproteobacteria（γ-變形菌綱）15%，另外Clostridia（梭狀芽胞桿菌綱）4%。Planctomycetes（浮霉菌門）5%、Actinobacteria（放線菌門）與Firmicutes（厚壁菌門）4%、Acidobacteria（酸桿菌門）12%、以及未知細(xì)菌37%左右。

3? 討論

環(huán)境中微生物的群落組成信息能反映出環(huán)境的特點(diǎn)，不同的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)體現(xiàn)出他們特殊的生態(tài)功能。本研究對(duì)富灣銀礦的研究結(jié)果進(jìn)行了分析，把土壤細(xì)菌類群的多樣性及各個(gè)類群所占的豐富度做了比較，發(fā)現(xiàn)Proteobacteria（變形菌門）是細(xì)菌中最大且多樣性比較豐富的一個(gè)門，這與在云南省瀾滄縣募乃鉛鋅礦區(qū)尾礦中的研究結(jié)果一致[6]。有研究表明，變形菌是一種富營(yíng)養(yǎng)菌，與土壤的養(yǎng)分呈正相關(guān)性[7]。因而變形菌更容易分解利用有機(jī)物，大量繁殖，形成優(yōu)勢(shì)菌種。在富灣銀礦的土壤樣品中發(fā)現(xiàn)α-變形菌優(yōu)勢(shì)菌群，占了21%，α-變形菌屬于兼性厭氧光能營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌[8]，是能廣泛適應(yīng)自然環(huán)境的菌種，具有適應(yīng)生境的生理特性，特別是能在厭氧條件下反硝化脫氮，在水體、底泥、土壤等多種生境下存活。富灣銀礦只是開采了一小部分，后被被制止開采，可能土壤的有機(jī)含量還是比較高，有半纖維素和蛋白質(zhì)等簡(jiǎn)單有機(jī)物。本研究也發(fā)現(xiàn)γ-變形菌綱在微生物群落里也是屬于主要的細(xì)菌類群，分析其原因是γ-變形桿菌適應(yīng)能力強(qiáng)，在廣泛分布于各種環(huán)境中;此外還存在有β-變形菌及伯克氏菌，β-變形菌也是厭氧異養(yǎng)型且能進(jìn)行光合作用的細(xì)菌。據(jù)研究表明該菌群可降解烴類等，在比較缺乏氮的環(huán)境中具有固定氮[9]的作用，而且在高濃度的硝酸鹽環(huán)境下具有反硝化能力，因而能夠忍受高堿高鹽的環(huán)境[10]。由此可以看出在環(huán)境惡劣礦區(qū)環(huán)境中，能夠進(jìn)行光合作用且能無(wú)機(jī)化能為自身細(xì)胞提供能量的細(xì)菌可以生活在礦區(qū)。