環(huán)狀RNA在慢性阻塞性肺疾病診斷及預(yù)后判斷中的研究?jī)r(jià)值

陳福濤 鐘富寬 白巧紅 卞光榮 楊飏 朱江

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種可以預(yù)防和治療的呼吸系統(tǒng)疾病,伴有明顯的肺外效應(yīng)。COPD主要表現(xiàn)為肺部不完全可逆性的氣流受限,同時(shí)氣流的受限通常是漸進(jìn)的,其程度往往與肺部對(duì)有害顆粒或氣體的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[1-2]。目前,COPD仍然是一項(xiàng)全球性的公共健康問(wèn)題:在美國(guó),COPD位居慢性致死致殘性疾病第4位;另?yè)?jù)一項(xiàng)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)和世界銀行聯(lián)合發(fā)布的研究推斷:到2020年COPD所帶來(lái)的社會(huì)負(fù)擔(dān)將躍居全球疾病負(fù)擔(dān)的第5位。因此,早發(fā)現(xiàn)早治療,對(duì)于改善COPD患者的預(yù)后十分重要。然而,嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康的COPD在早期僅表現(xiàn)為生物化學(xué)和細(xì)胞水平事件且無(wú)明顯臨床癥狀,因此,其早期診斷比較困難。尋找新型、有效的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)對(duì)于其臨床診斷和治療具有重要的意義。

近年來(lái),非編碼核糖核酸(non-coding ribonucleic acid,ncRNA)在疾病發(fā)病機(jī)制領(lǐng)域的研究不斷升溫,且研究?jī)?nèi)容越來(lái)越深入。其中,作為新型ncRNA的環(huán)狀核糖核酸(circular ribonucleic acid,circRNA),因其獨(dú)特的性質(zhì)和豐富的功能,成為目前疾病分子機(jī)制研究中的新寵。隨著RNA測(cè)序和生物信息學(xué)等技術(shù)的發(fā)展,circRNA被發(fā)現(xiàn)大量存在于真核細(xì)胞中并參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,還可通過(guò)微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)海綿作用來(lái)調(diào)控基因的表達(dá),從而在疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]。作為ncRNA的一種,miRNA與多種疾病的關(guān)聯(lián)性已經(jīng)得到了廣泛研究,關(guān)于COPD的研究也逐漸增加。目前,越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道了miRNA的異常表達(dá)與COPD的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[5]。盡管關(guān)于circRNA與COPD的研究甚少,但考慮到miRNA在氣道炎癥性疾病中的意義以及circRNA作為miRNA海綿的作用,circRNA有望成為COPD臨床診斷和預(yù)后判斷的新興生物分子標(biāo)志物,并將對(duì)疾病的治療策略提供新的研究思路。因此,筆者猜想:作為miRNA海綿的circRNA也可能通過(guò)阻斷miRNA對(duì)其靶基因的抑制作用來(lái)改變靶基因的表達(dá)水平,在轉(zhuǎn)錄后層面調(diào)控變應(yīng)性疾病的免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng),從而調(diào)控氣道炎癥性疾病的發(fā)生和進(jìn)展;另外,作為一種競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性核糖核酸(competing endogenous ribonucleic acid,ceRNA),circRNA還可能調(diào)節(jié) miRNA選擇性剪接的過(guò)程,即通過(guò)它們與親本基因剪接的競(jìng)爭(zhēng)作用促進(jìn)親本基因的轉(zhuǎn)錄[4],從而與氣道變應(yīng)性疾病相關(guān)聯(lián);同時(shí),circRNA亦可能通過(guò)circRNA-miRNA-gene通路來(lái)調(diào)控信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)的表達(dá)水平。

為探究該猜想的科學(xué)性和正確性,連云港市第二人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室在COPD發(fā)病機(jī)理與防治等方面做了大量前期研究:通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)circRNA-001988、circRNA-0000344和circRNA-0000284在肺癌患者中異常表達(dá),并且能調(diào)控肺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程,提示circRNA在肺相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[4]。本研究基于文獻(xiàn)調(diào)研和前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,通過(guò)Arraystar circRNA芯片篩選獲得兩組受試者血清樣本中差異表達(dá)的circRNA,再利用qRT-PCR驗(yàn)證了獲得的目標(biāo)circRNA分子,探究了circRNA在COPD中的表達(dá)情況及其對(duì)疾病病程發(fā)展的影響,以期為COPD的臨床診斷和預(yù)后判斷提供參考性生物標(biāo)志物。

臨床資料和方法

一、一般資料

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸分會(huì)指南中COPD的診斷。(2)年齡≤90歲。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)限制性通氣功能障礙患者。(2)伴有其他可影響肺功能結(jié)果的慢性系統(tǒng)性疾病及嚴(yán)重疾病的。(3)支氣管舒張?jiān)囼?yàn)陽(yáng)性的患者。(4)不能交流及不愿意配合的患者。共納入2014年1月至2016年12月在連云港市第二人民醫(yī)院醫(yī)院呼吸科住院及門(mén)診治療的80例COPD患者和同期在該院健康體檢人群30例為研究對(duì)象進(jìn)行回顧性研究,其中男性 58 例,女性 52 例;年齡61～82歲,平均(70±6)歲。本研究獲得連云港市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),所有參與的受試者均簽署了知情同意書(shū)。

二、主要試劑和儀器

TRIzol試劑(重慶普立科生物技術(shù)有限公司);異丙醇(江蘇省宜興市華生化工有限 公司);Arraystar Super RNA Labeling Kit(阿瑞星超級(jí)RNA)標(biāo)記試劑盒(上海康成生物工程有限公司)。基因芯片掃描儀(安捷倫公司,G2505C);焦碳酸二乙酯 (上海研生生化試劑有限公司)。

三、方法

(一)診斷與分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.診斷標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的COPD診斷和治療指南[6]對(duì)患者進(jìn)行臨床診斷。即吸入支氣管舒張劑后,1 s用力呼氣容積占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC%)<70%。

2.分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)吸入支氣管舒張劑后,FEV1占預(yù)計(jì)值百分比下降的程度進(jìn)行氣流受限嚴(yán)重程度肺功能分級(jí)。(1)Ⅰ級(jí)(輕度):FEV1占預(yù)計(jì)值百分比≥80% 。(2)Ⅱ級(jí)(中度):50%≤FEV1占預(yù)計(jì)值百分比<80% 。(3)Ⅲ級(jí)(重度):30%≤FEV1占預(yù)計(jì)值百分比<50% 。(4)Ⅳ級(jí)(極重度):FEV1占預(yù)計(jì)值百分比<30%,合并慢性呼吸衰竭。

(二)一般資料獲取

對(duì)患者的年齡、性別、病程等一般資料進(jìn)行記錄。對(duì)照組記錄年齡、性別等資料。

(三)circRNA提取

1.樣本的收集:采集所有研究對(duì)象早晨空腹的靜脈血3 mL,并編號(hào)記錄,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.總核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)的提取:為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)性和可靠性,減少操作環(huán)境污染帶來(lái)的誤差,標(biāo)本提取在超凈臺(tái)完成,所有材料進(jìn)行滅菌處理。(1)-80℃冰箱簡(jiǎn)單隨機(jī)法隨機(jī)選取3例COPD患者及3例正常對(duì)照組血液樣本,置于2～8℃冰箱使之溶解,加入3倍體積紅細(xì)胞裂解液,混勻后室溫放置10 min,10 000 r/min離心1 min。徹底吸棄上清,收集白細(xì)胞沉淀。每100～200 μL血液收集的白細(xì)胞沉淀加入1 mL總RNA抽提試劑TRIzol。室溫放置5 min,使樣品充分裂解。4℃ 12 000 r/min離心10 min,取上清。(2)將上清轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中,冰上靜置5 min,加入0.2 mL三氯甲烷,劇烈震蕩約10 s混合均勻后室溫放置3 min,4℃ 12 000 r/min離心15 min。(3)將上清小心轉(zhuǎn)入新的潔凈1.5 mL EP管中,加入等體積異丙醇,輕輕震蕩混勻,-20℃放置30 min,4℃ 12 000 r/min離心10 min,小心移棄上清液。(4)加入1 mL 75%乙醇混勻,4℃ 7 500 r/min離心5 min。再用無(wú)水乙醇洗滌,4℃ 12 000 r/min離心2 min后用移液器小心吸棄上清液EP管置于超凈工作臺(tái)風(fēng)干5～10 min。(5)平均加入約20 μL焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水溶解、稀釋總RNA,沉淀較少的可適量減量。(6)利用NanoDrop ND-1000對(duì)所提取的RNA的純度和濃度進(jìn)行測(cè)定。

3.circRNA 芯片檢測(cè):(1)先用核糖核酸酶R(ribonuclease R,RNase R)消化總RNA,去除線性RNA,富集circRNAs。(2)將富集后的circRNAs采用隨機(jī)引物轉(zhuǎn)錄,擴(kuò)增為熒光標(biāo)記的互補(bǔ)核糖核酸(complementary ribonucleic acid,cRNA)探針。cRNAs 探針與阿瑞星人類(lèi)circRNA 序列表達(dá)譜芯片(Arraystar Human circRNA Array)—(8×15 K)表達(dá)譜芯片上的寡核苷酸片段雜交,基因芯片掃描儀掃描,安捷倫數(shù)據(jù)提取軟件(Agilent Feature Extraction Software)(Version 11.0.1.1)分析雜交結(jié)果。

4.定量即時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)驗(yàn)證候選的circRNA:將剩余的77例COPD患者及27例正常對(duì)照者的血液樣本利用TRIzol法提取總RNA后,兩組分別取1.5 μg總RNA,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA),體系如下(反應(yīng)體系50 μL):進(jìn)行目的基因的即時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè):根據(jù)circRNA芯片的檢測(cè)結(jié)果,在circRNA數(shù)據(jù)庫(kù)“circBase”(http://circbase.mdc-berlin.de)中查找候選circRNA的序列,依據(jù)circRNA引物設(shè)計(jì)的原則設(shè)計(jì)候選circRNA的發(fā)散引物(divergent primer),送至康成生物公司進(jìn)行合成。

RNA模板5 μL引物divergent5 μL緩沖液5×RT10 μL脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)10 mM2.5 μL逆轉(zhuǎn)錄酶2 μLDEPC-H2O25.5 μL

反應(yīng)條件:30℃,10 min → 42℃,60 min → 95℃,10 min。合成的cDNA 4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

利用設(shè)計(jì)合成的引物,通過(guò)普通聚合酶鏈鎖反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)摸索最佳退火溫度,再利用RT-PCR試劑盒進(jìn)行定量,實(shí)時(shí)定量PCR體系如下:反應(yīng)體系20 μL：以β-actin為內(nèi)參,對(duì)COPD患者及正常對(duì)照者血液樣本中候選的circRNA進(jìn)行定量。各個(gè)基因產(chǎn)物測(cè)序完全符合的作為陽(yáng)性對(duì)照,用來(lái)排除假陰性。不加模板的反應(yīng)體系作為陰性對(duì)照,用以排除基因組DNA的污染。

cDNA2 μL2×SYBR Green Mix10 μLForward Primer(10 μM)1 μLReverse Primer(10 μM)1 μLDEPC-H2O6 μL

反應(yīng)條件:95 ℃,10 min → 95 ℃,20 s→最佳退火溫度,30 s → 72 ℃,30 s。

5.目標(biāo)circRNA的注釋和功能預(yù)測(cè):(1)circRNA-miRNA-gene network的繪制:利用在線分析工具Target Scan(http://www.targetscan.org/)和miRanda(http://www.microrna.org/),以目標(biāo)circRNA的序列為seed序列,繪制circRNA-miRNA-gene網(wǎng)絡(luò)。(2)circRNA-miRNA-mRNA interaction network:利用在線分析工具Cytoscape(http://www.cytoscape.org/),以目標(biāo)circRNA為節(jié)點(diǎn),繪制circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中預(yù)測(cè)的目標(biāo)circRNA功能利用GO和KEGG信號(hào)通路分析進(jìn)行注釋。

6.利用數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)一步分析COPD中目標(biāo)circRNA與COPD診斷及預(yù)后的相關(guān)性研究

四、觀察指標(biāo)

circRNA-001988、circRNA-0000344和circRNA-0000284在COPD組和正常組血液中的表達(dá)情況。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

circRNA-001988、circRNA-0000344和circRNA-0000284在COPD患者的血液樣本中均異常表達(dá):與對(duì)照組相比,circRNA-001988和circRNA-0000344在COPD組中分別下調(diào)了(6.54±2.75)倍和(5.94±2.89)倍,見(jiàn)圖1～2。circRNA-0000284在COPD組中則上調(diào)了(8.54±3.25)倍,見(jiàn)圖3。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

目前,COPD仍然是一項(xiàng)全球性的公共健康問(wèn)題。在美國(guó),COPD位居慢性致死致殘性疾病第4位。另?yè)?jù)一項(xiàng)由WHO和World Bank聯(lián)合發(fā)布的研究推斷,到2020年COPD所帶來(lái)的社會(huì)負(fù)擔(dān)將躍居全球疾病負(fù)擔(dān)的第5位。在我國(guó),尤其是我國(guó)農(nóng)村地區(qū),COPD的發(fā)病率較高,2018年新發(fā)布的我國(guó)COPD流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示:40歲以上人群的COPD發(fā)病率高達(dá)13.7%;老年COPD患者急性加重期的病情較重,發(fā)病率也較高,這主要是因?yàn)槔夏昊颊咄ǔ：喜⑤^多基礎(chǔ)疾病,且多系統(tǒng)疾病極易累積呼吸系統(tǒng),從而造成老年COPD患者的發(fā)病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì),該人群COPD發(fā)病率已從2000年的11.33%上升至2010年的17.21%[4],這個(gè)情況應(yīng)引起高度重視。因此,早發(fā)現(xiàn)早治療對(duì)COPD患者的預(yù)后十分重要。由于COPD嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康,但在疾病的早期僅表現(xiàn)為生物化學(xué)和細(xì)胞水平事件,且無(wú)明顯臨床癥狀,診斷比較困難,因此尋找新的、有效的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)對(duì)于COPD的診斷和治療具有重要的意義。DNA元素百科全書(shū)(encyclopedia of dna elements,ENCODE)項(xiàng)目證實(shí):90%的基因組是被轉(zhuǎn)錄的[7],但僅有2%的轉(zhuǎn)錄體被用于編碼蛋白,其余的都是ncRNA,包括miRNA(<200 ns)、circRNA、長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸(long non-coding ribonucleic acid,lncRNA)等。這些ncRNA在大多數(shù)物種的基因組中高度保守,可以影響多種生物過(guò)程,包括腫瘤、心血管疾病及肺疾病的發(fā)生和發(fā)展。一些研究已經(jīng)證實(shí),許多疾病有其特有和差異表達(dá)的ncRNA,可以作為多種人類(lèi)疾病的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)分子標(biāo)志物,這對(duì)疾病的早期診斷和預(yù)后判斷具有重要意義[8]。近年來(lái),這些ncRNA以其多樣性、高效性、特異性、多靶點(diǎn)的調(diào)控特點(diǎn),成為一種多層次、多途徑的疾病治療新策略研究的熱點(diǎn)。

圖1 circRNA-001988 在COPD組和健康對(duì)照組中的表達(dá)(*P≦0.01)

圖2 circRNA-0000344 在COPD組和健康對(duì)照組中的表達(dá)(*P≦0.01)

圖3 circRNA-0000284 在COPD組和健康對(duì)照組中的表達(dá)(*P≦0.01)

miRNA作為ncRNA中的一種,在多種疾病中的作用被廣泛研究,在COPD中的研究也逐漸增加。Akbas等[9]利用qRT-PCR發(fā)現(xiàn)了5種miRNA在COPD患者血清中差異表達(dá):miR-20a、miR-28-3p、miR-34c-5p、miR-100較正常組下調(diào);miR-7則上調(diào),并且miR-7的上調(diào)與COPD顯著有關(guān),提示miR-7可能可以作為COPD診斷的潛在分子標(biāo)志物。Soeda等[10]研究發(fā)現(xiàn):血漿中循環(huán)miR-106b在COPD患者中的表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照組,且miR-106b的表達(dá)水平與COPD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Leidinger等[11]在研究中比較了肺癌組、COPD組、健康對(duì)照組的外周血中miRNA的表達(dá)情況:與健康對(duì)照組相比,肺癌組與COPD組的miRNA表達(dá)變化更相似;并且借助miRNA的表達(dá)結(jié)果分析能夠以90.4%的準(zhǔn)確率、89.2%的特異性和91.7%的靈敏度區(qū)分肺癌患者和COPD患者?？傮w而言,通過(guò)這研究結(jié)果可以肯定,血液中miRNA的變化特征可用于鑒別診斷COPD與肺癌。目前,越來(lái)越多文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA在COPD中異常表達(dá),并與COPD的發(fā)生發(fā)展具有一定的相關(guān)性[12]。且miRNA表達(dá)是具有時(shí)效性的,呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)表達(dá)變化,這可以間接反映在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路和微環(huán)境的變化。所以將miRNA作為COPD的生物標(biāo)志物或是COPD治療靶點(diǎn)是非常有潛力的。

但是另一種ncRNA——circRNA在COPD中的研究就相對(duì)較少。circRNA是近年來(lái)腫瘤研究領(lǐng)域的明星分子之一,它最早被發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)70年代的RNA病毒中,也屬于ncRNA家族成員。與線性RNA不同,circRNA沒(méi)有5′帽子,也沒(méi)有3′尾巴,而是一種共價(jià)閉合的單股環(huán)狀分子。circRNA主要來(lái)源于蛋白編碼基因的外顯子,也可由內(nèi)含子、基因間區(qū)、UTR區(qū)、非編碼RNA位點(diǎn)和已知轉(zhuǎn)錄物的反義位點(diǎn)產(chǎn)生,見(jiàn)圖4。circRNA具有高度保守、穩(wěn)定性強(qiáng)、特異性高、含量相對(duì)豐富的特點(diǎn),可以作為miRNA海綿或ceRNA調(diào)控靶miRNA的活性,并參與基因轉(zhuǎn)錄和蛋白生成的調(diào)控,見(jiàn)圖5。

圖4 環(huán)狀RNA生物合成模型

圖5 三個(gè)調(diào)節(jié)親本基因表達(dá)的環(huán)狀RNA模型

circRNA參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展,如動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、朊病毒疾病與癌癥等,在結(jié)直腸癌與胰腺導(dǎo)管腺癌中異常表達(dá)[13]。研究證實(shí):CDR1as在腦中高表達(dá),有超過(guò)60個(gè)miR-7的結(jié)合位點(diǎn),同時(shí)miR-7被證實(shí)既可以作為原癌基因,又可以作為抑癌基因,在多種信號(hào)通路和疾病中發(fā)揮作用,是α-突觸核蛋白和泛素結(jié)合酶E2A(ubiquitin conjugating enzyme E2A,UBE2A)的直接調(diào)控者,CDR1as與帕金森綜合征、阿爾茲海默癥以及腦的發(fā)育相關(guān)。因此,CDR1as/miR-7在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。Wang等[4]研究發(fā)現(xiàn):心臟相關(guān)的circRNA(HRCR)可作為miR-223的吸附體,抑制心臟肥大和心力衰竭。此外,在果蠅中,circRNA被證實(shí)是衰老的生物標(biāo)志物;在人類(lèi)唾液中的circRNA也可作為潛在的疾病相關(guān)的標(biāo)志物[14-15]。近期研究證實(shí)在外泌體中亦存在豐富的circRNA,可以作為某些疾病診斷的分子標(biāo)志物[16]。Ng等[17]研究顯示:脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的circRNA-mcircRasGEF1B可以通過(guò)TLR4/NF-κB 信號(hào)通路正性調(diào)控ICAM-1 mRNAs的表達(dá),敲除mcircRasGEF1B能降低LPS誘導(dǎo)的ICAM-1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平,從而影響炎癥反應(yīng)過(guò)程。Wan等[18]對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性呼吸窘迫綜合征大鼠肺組織中circRNAs的表達(dá)譜進(jìn)行微陣列分析,發(fā)現(xiàn)有957個(gè)circRNAs在大鼠肺組織中有差異性表達(dá)。由此可見(jiàn),circRNA參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展,其與miRNA 的相互作用對(duì)于相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制研究具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)室以連云港市第二人民醫(yī)院為依托,在COPD發(fā)病機(jī)理及防治等方面做了大量的研究工作,并發(fā)表了相關(guān)文章。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)circRNA-001988,circRNA-0000344和circRNA-0000284在肺癌中異常表達(dá),并且能調(diào)控肺癌的發(fā)生發(fā)展,提示circRNA在肺相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色,但是circRNA在COPD中的研究甚少。本項(xiàng)目收集在連云港市第二人民醫(yī)院住院和門(mén)診就診的80例COPD患者及同期在該院進(jìn)行健康體檢的30例對(duì)照組為研究對(duì)象,通過(guò)Arraystar circRNA芯片篩選獲得兩組受試者血液樣本中差異表達(dá)的circRNA為circRNA-001988、circRNA-0000344和circRNA-0000284。再利用qRT-PCR驗(yàn)證了獲得的目標(biāo)circRNA分子,并結(jié)合生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行注釋和功能預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示:與正常組相比,circRNA-001988、circRNA-0000344在COPD組中分別下調(diào)了(6.54±2.75)倍和(5.94±2.89)倍,circRNA-0000284則在COPD組中上調(diào)了(8.54±3.25)倍。因此,circRNA可作為COPD的診斷和預(yù)后判斷生物標(biāo)志物,本研究結(jié)果為進(jìn)一步闡釋circRNA在COPD發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。