鐘方權(quán)，黃瑤，沈婉瑩，付彬，汪超，徐寧

(湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心,武漢 430068)

醬油是產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣泛的發(fā)酵豆類制品,內(nèi)含氨基酸、糖類、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分[1]。它是以大豆或脫脂大豆、小麥或麩皮為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵而制成的具有特殊色、香、味的液體調(diào)味品[2]。我國(guó)醬油釀造普遍采用單一米曲霉制曲，但由于發(fā)酵過程是半開放式，發(fā)酵體系實(shí)際上是由多種微生物構(gòu)成，參與的微生物種類繁多，發(fā)酵過程中微生物群落不斷地演替變化，最終完成大分子原料的降解、轉(zhuǎn)化、代謝等過程[3]。復(fù)雜的微生物群落產(chǎn)生了豐富的有機(jī)酸、氨基酸、脂肪酸、醇、酯、酚等代謝產(chǎn)物，故復(fù)雜但有規(guī)律的微生物群落組成是賦予傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品獨(dú)特風(fēng)味品質(zhì)的關(guān)鍵[4,5]。這些微生物來自幾十種細(xì)菌和真菌種屬，例如乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、腸球菌屬、曲霉菌屬、球擬酵母屬等[6-9]。

目前關(guān)于多菌種制曲發(fā)酵以及添加其他風(fēng)味微生物參與醬油釀造的研究較多，添加的菌種主要集中在曲霉菌(如黑曲霉)、紅曲菌、耐鹽的風(fēng)味酵母和耐鹽乳酸菌等[10-12]。而大量的研究證實(shí)在醬油曲料的微生物群落分析中有大量的非耐鹽乳酸菌，而對(duì)于非耐鹽乳酸菌對(duì)于醬油曲料品質(zhì)以及最終醬油中活性物質(zhì)的影響尚不明確，因此，本研究通過在制曲過程中添加篩選自醬油中的非耐鹽乳酸菌(耐腸球菌)，研究其對(duì)制曲酶活力的影響，為探索醬油微生物菌群的作用奠定了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉(Aspergillusoryzae)AS3.951、乳酸菌(耐腸球菌Enterococcusdurans)：保藏于湖北工業(yè)大學(xué)湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心；豆粕：市售；焙炒小麥：自行炒制。

福林酚、酪蛋白、羧甲基纖維素鈉、3，5-二硝基水楊酸、D-半乳糖醛酸等試劑：購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

UV-1601紫外可見分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器有限公司;CT15RE高速冷凍離心機(jī) 日立工機(jī)株式會(huì)社；MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌鍋 松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 米曲霉和乳酸菌的培養(yǎng)

米曲霉在豆汁培養(yǎng)基上接種并進(jìn)行2次傳代后，在32 ℃培養(yǎng)72 h，再將其轉(zhuǎn)接到三角瓶固態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，每克曲料中孢子數(shù)約7.0×109個(gè)，置于4 ℃冰箱保存待用。耐腸球菌在MRS培養(yǎng)基活化2次后，于33 ℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，菌落總數(shù)約為1.0×1010CFU/mL。

1.3.2 制曲工藝流程

豆粕加1.2倍水潤(rùn)濕1 h后與一定比例的炒小麥混合均勻，于115 ℃高溫滅菌鍋滅菌20 min，冷卻至室溫，按一定接種比例接入米曲霉種曲和乳酸菌，隨后放入制曲室恒溫培養(yǎng)直至制曲結(jié)束，期間翻曲2次。單因素實(shí)驗(yàn)條件見表1。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)條件

1.3.3 蛋白酶(中性、酸性)活力的測(cè)定

采用福林酚法測(cè)定蛋白酶活力[13]，中性蛋白酶的測(cè)定采用pH為7.2的磷酸緩沖液；酸性蛋白酶的測(cè)定在pH為3.0的乳酸鈉緩沖液中進(jìn)行。在40 ℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸所需的酶量定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。

1.3.4 纖維素酶活力的測(cè)定

纖維素酶活力的測(cè)定參照DNS顯色法[14]，酶活的定義：在40 ℃、pH 4.8條件下，每分鐘催化羧甲基纖維素鈉底物降解釋放1 μmol葡萄糖所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.3.5 果膠酶活力的測(cè)定

果膠酶活力的測(cè)定同樣參考DNS顯色法[15]，酶活的定義：在40 ℃、pH 4.8條件下，每分鐘催化水解果膠釋放1 μg D-半乳糖醛酸所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 原料配比對(duì)曲料中酶活的影響

本研究選取豆粕和炒小麥為制曲原料，經(jīng)炒制后的小麥減少了部分含水量，更有利于儲(chǔ)存，也可減少雜菌的生長(zhǎng)，另外，高溫炒制可以使部分酶失去活性，蛋白質(zhì)的適度變性更有利于微生物的吸收轉(zhuǎn)化，由于選取的原料中蛋白質(zhì)含量以及纖維素果膠含量較高，所以選取中性蛋白酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶的酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)來優(yōu)化制曲過程中最佳的原料配比，此外，制曲過程中所產(chǎn)酶系多樣化的研究，也可為后期醬油的發(fā)酵提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

原料配比對(duì)制曲過程中4種酶的影響規(guī)律見圖1。當(dāng)原料豆粕與炒小麥的比例為6∶4時(shí)，曲料中中性蛋白酶、酸性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶的酶活力可達(dá)到最佳水平，為2195.65，612.43，47.72，25.48 U/g，且顯著優(yōu)于其他組。因此，采用豆粕與炒小麥的比例為6∶4的制曲工藝生產(chǎn)的醬油品質(zhì)更高。

圖1 不同原料比例對(duì)酶活的影響

2.1.2 米曲霉接種量對(duì)曲料中酶活的影響

圖2 不同米曲霉接種量對(duì)酶活的影響

由圖2可知米曲霉的接種量對(duì)曲料中4種酶活力的影響，隨著米曲霉接種量的增加，4種酶的活力在緩慢增加。在米曲霉接種量為0.5%時(shí)，成品曲料中的4種酶活力值達(dá)到最優(yōu)，分別為2332.45，532.89，23.68，47.78 U/g。所以，當(dāng)米曲霉接種量為0.5%時(shí)，能獲得更好的曲料。

2.1.3 乳酸菌接種量對(duì)曲料中酶活的影響

圖3 不同乳酸菌接種量對(duì)酶活的影響

由圖3可知不同乳酸菌添加量對(duì)4種酶活的影響，隨著乳酸菌接種量的增加，除中性蛋白酶外，其他酶都呈先增后減的趨勢(shì)。當(dāng)乳酸菌接種量為1.0 mL/100 g(每1 mL菌液含有1.0×1010CFU/個(gè)乳酸菌)時(shí)，其成曲中中性蛋白酶可達(dá)到2034.53 U/g，比接種量為0.4 mL/100 g時(shí)降低了7%；但此時(shí)成曲中酸性蛋白酶、纖維素酶和果膠酶分別為622.43，25.48，46.72 U/g，比接種量為0.4 mL/100 g的曲料組提高了1.02倍、1.16倍和1.13倍。由此可得，選取乳酸菌接種量為1.0 mL/100 g時(shí)最佳。

2.1.4 制曲溫度對(duì)曲料中酶活的影響

溫度對(duì)制曲品質(zhì)的好壞至關(guān)重要。在當(dāng)今的醬油實(shí)際釀造生產(chǎn)過程中，在制曲過程中，通常會(huì)采取通風(fēng)培養(yǎng)方式，通風(fēng)也是為了給好氧微生物如米曲霉提供足夠的氧氣，故控制通風(fēng)量是控制溫度的關(guān)鍵操作技術(shù)。制曲溫度的不同對(duì)4種酶活的影響見圖4。

圖4 不同制曲溫度對(duì)酶活的影響

由圖4可知，在制曲溫度在36～39 ℃時(shí)，4種酶的酶活力大大下降，故此溫度控制尤為重要。當(dāng)溫度保持在32～35 ℃之間時(shí)，醬油成品曲料中4種酶的酶活力達(dá)到最高水平，中性蛋白酶為2265.78 U/g，酸性蛋白酶為520.66 U/g，纖維素酶為25.44 U/g，果膠酶為46.67 U/g，因此， 32～35 ℃為最優(yōu)的制曲溫度范圍。

2.1.5 制曲時(shí)間對(duì)曲料中酶活的影響

制曲時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)曲料品質(zhì)的影響也至關(guān)重要，制曲時(shí)間過短，酶系和產(chǎn)酶量可能不足，影響原料的使用率，降低成曲品質(zhì)；制曲時(shí)間過長(zhǎng)，酶的活力可能會(huì)下降且后期霉菌的大量繁殖、孢子的大量生成會(huì)影響成品醬油的色澤。

圖5 不同制曲時(shí)間對(duì)酶活的影響

由圖5可知，當(dāng)制曲時(shí)間為36～44 h，可使成曲達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，此時(shí)成曲中中性蛋白酶、酸性蛋白酶、纖維素酶和果膠酶的酶活力分別為2182.53，613.43，24.58，47.68 U/g，且與40 h制備得到的成曲中酶系活力無顯著差異。因此，初步確定制曲時(shí)間為36～40 h。

2.2 制曲工藝的正交優(yōu)化

本研究以5個(gè)因素(米曲霉接種量、乳酸菌接種量、原料配比、制曲時(shí)間、制曲溫度)、4種酶(纖維素酶、果膠酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶)的酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采取五因素四水平的正交試驗(yàn)，采用正交試驗(yàn)極差分析法研究最優(yōu)的制曲工藝，結(jié)果見表2～表6。

表2 正交試驗(yàn)

表3 中性蛋白酶酶活極差表

表4 酸性蛋白酶酶活極差表

表5 纖維素酶酶活極差表

表6 果膠酶酶活極差表

中性蛋白酶：各因素對(duì)其的影響順序?yàn)槊浊菇臃N量>乳酸菌接種量>原料配比>制曲溫度>制曲時(shí)間，最優(yōu)的制曲條件為米曲霉接種量0.5%，乳酸菌接種量0.4 mL/100 g，原料配比5∶5，制曲溫度24～27 ℃，制曲時(shí)間44 h。酸性蛋白酶：各因素對(duì)其的影響順序?yàn)橹魄鷾囟?米曲霉接種量>乳酸菌接種量>原料配比>制曲時(shí)間，最優(yōu)的制曲條件為米曲霉接種量0.4%，乳酸菌接種量1.0 mL/100 g，原料配比5∶5，制曲溫度32～35 ℃，制曲時(shí)間40 h。纖維素酶：各因素對(duì)其的影響順序?yàn)橹魄鷾囟?乳酸菌接種量>制曲時(shí)間>米曲霉接種量>原料配比，最優(yōu)的制曲條件為米曲霉接種量0.4%，乳酸菌接種量1 mL/100 g，原料配比5∶5，制曲溫度32～35 ℃，制曲時(shí)間40 h。果膠酶：各因素對(duì)其的影響順序?yàn)橹魄鷾囟?米曲霉接種量>制曲時(shí)間>原料配比>乳酸菌接種量，最優(yōu)的制曲條件為米曲霉接種量0.4%，乳酸菌接種量1.0 mL/100 g，原料配比6∶4，制曲溫度32～35 ℃，制曲時(shí)間40 h。

因此，綜合考慮，確定制曲的最佳工藝條件為：米曲霉接種量0.4%，乳酸菌接種量1.0 mL/100 g，原料配比6∶4，制曲溫度32～35 ℃，制曲時(shí)間40 h。

3 結(jié)論

制曲過程中酶系的豐富程度以及酶活力的大小是決定后期醬油發(fā)酵過程中質(zhì)量指標(biāo)的關(guān)鍵，最終影響醬油的品質(zhì)。本文選取酸性蛋白酶、中性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶4種酶的酶活力為成曲曲料品質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定了乳酸菌與米曲霉共生制曲的最優(yōu)工藝條件：原料中豆粕與炒小麥的比例為6∶4，制曲溫度為32～35 ℃，制曲時(shí)間為40 h，米曲霉的接種比例為0.4%，乳酸菌的添加量為1.0 mL/100 g。