黃亞 宿懷予 范秀 周榮 廖昌軍
摘要:探討甘露飲中6種有效成分(綠原酸、麥角甾苷、抽皮苷、黃琴苷、甘草酸、熊果酸)最佳提取工藝條件及含量測定方法。優(yōu)化提取溶劑,通過正交試驗法考察料液比、提取時間和提取次數對甘露飲提取工藝的影響。采用Syneronis C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動相乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)梯度洗脫(0~5mm,5% A;5~40min,5%~20% A;40~60min,20%~50% A;60~80min,50%~90% A;80~90.1min,90%~5% A;90.1~100min,5%A),流量1.0mL/min,柱溫35℃,檢測波長210nm,進樣量20μL的色譜條件對甘露飲提取物中6種有效成分進行含量測定。最佳提取工藝條件是:60%乙醇為提取溶劑,料液比1:4,提取時間為1h,提取次數為1次。綠原酸、麥角甾苷、抽皮苷、黃芩苷、甘草酸、熊果酸分別在4.80~80.00,10.00~100.00,24.00~400.00,30.00~500.00,6.00~100.00,3.60~60.00μg/mL濃度范圍內線性關系良好(r2≥0.9995)。平均加樣回收率在96.12%~101.82%,RSD在1.72%~2.92%。該提取工藝穩(wěn)定可行,HPLC法能簡便、準確地測定甘露飲提取物中6種有效成分的含量。
關鍵詞:甘露飲;正交試驗;綠原酸;麥角甾苷;柚皮苷;黃芩苷;高效液相色譜
中圖分類號:R580 文獻標志碼:A 文章編號:1674-5124(2019)06-0081-07
收稿日期:2018-11-12;收到修改稿日期:2018-12-20
基金項目:德陽市科技局支撐計劃(2016SZ033)
作者簡介:黃亞(1988-),女,四川成都市人,主管藥師,碩士,主要從事臨床藥學研究。
通信作者:廖昌軍(1981-),男,四川自貢市人,高級實驗師,碩士,主要從事藥物分析研究工作。
0 引言
甘露飲出自《太平惠民和劑局方·卷六》,由生地黃、熟地黃、麥冬、天冬、石解、積殼、茵陳、黃芩、批把葉、甘草組成,具有滋陰生津,清熱解毒,祛濕和中的功效[1],目前臨床廣泛用于放射性口腔炎、復發(fā)性口腔黏膜潰瘍、慢性咽炎、慢性淺表性胃炎、濕熱陽痿、角結膜干燥癥等[2-3]。甘露飲中多種成分相輔相成、協(xié)同作用是其藥理作用的重要基礎,而各種潛在活性成分的含量與臨床治療效果密切相關。綠原酸是茵陳的有效成分之一,具有清除體內自由基、抗氧化、抗菌、抗病毒和保肝利膽等作用[47。麥角甾苷是地黃中苯乙醇苷類成分的代表。柚皮苷為積殼中黃酮類成分之一,具有抗氧化、抗變態(tài)反應、抑制胃腸道平滑肌作用[5]。黃芩苷是黃芩的指標性成分,具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗癌等藥理作用[6-7]。甘草酸是甘草中最主要的活性成分,具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、免疫調節(jié)等作用[8]。熊果酸是批把葉中有效成分,具有保肝、消炎、抗腫瘤、調血脂、免疫雙向調解等藥理作用。在國內外研究中分別關于綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸和熊果酸的含量提取及測定方法有相關報道[9-15],而甘露飲中多種代表性活性成分的提取及同時定量,國內外尚未見文獻報道。因此,本實驗采用了正交試驗法,以6種有效成分綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸和熊果酸的含量為指標,對甘露飲的提取工藝進行研究,優(yōu)選出最佳提取工藝,同時建立了HPLC法測定6種有效成分的含量,為完善甘露飲質量評價標準和臨床用藥提供依據。
1 材料與儀器
1.1 儀器
1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司);烘箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠);XW-80A型旋渦混合器(上海青浦滬西儀器廠);旋轉蒸發(fā)儀(德國IKA);CP225D型電子天平(德國賽多利斯公司);粉碎機(吉首市中誠制藥機械廠)。
1.2 材料
每批甘露飲處方藥材包括生地黃15g、熟地黃15g、麥冬15g、天冬15g、石斛15g、積殼10g、茵陳10g、黃芩10g、批把葉10g、甘草6g(均購自四川博仁藥業(yè)有限公司,批號分別為171001,180201,180401,180301,171001,180101,180401,180302,180301,180201,均符合2010年版《中國藥典))和《衛(wèi)生部藥品標準》有關規(guī)定);綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸和熊果酸對照品(成都植標化純生物技術有限公司,批號分別為180302,180213,180119,180221,180105,180626,純度均≥99%);甲醇、乙腈為色譜純(Fisher),磷酸為色譜純(成都市科隆化學試劑有限公司),乙醇為分析純,水為超純水。
2 方法與結果
2.1 色譜條件
Syncronis C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動相乙腈(A)-0.1磷酸水溶液(B)梯度洗脫(0~5min,5% A;5~40min,5%~20% A;40~60min,20%~50% A;60~80min,50%~90% A;80~90.1min,90%~5% A:90.1~100min,5%A),流量1.0mL/min,柱溫35℃,檢測波長210nm,進樣量20μL。
2.2 混合對照品溶液制備
精密稱取綠原酸對照品5.0mg,麥角甾苷對照品5.0mg,柚皮苷對照品40.0mg,甘草酸對照品10.0mg,用70%乙腈定容至10mL。精密稱取黃芩苷對照品10.0mg,熊果酸對照品5.0mg,用甲醇定容至5mL量瓶中,作為單個對照品貯備液,分別吸取上述6種單個對照品貯備液1.6,2.0,1.0,2.5,1.0,1.2mL于10mL量瓶中,70%乙腈定容至刻度,即得綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸和熊果酸(質量濃度分別為80,100,400,500,100,60μg·mL-1)混合對照品貯備液,冷藏備用。
2.3 供試品溶液制備
按處方量稱取相應量的甘露飲中藥材,粉碎過10目篩。稱取甘露飲粗粉,用60%乙醇提取,料液比1:4,提取時間為1h,提取次數為1次,旋轉蒸發(fā)儀濃縮至粘稠狀后,烘干得浸膏。精密稱取浸膏0.1g,加入70%乙腈定容至10mL,即得。
2.4 系統(tǒng)適應性實驗
分別取混合對照品溶液和供試品溶液按2.1項下色譜條件測定,結果綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸及熊果酸的保留時間分別為14.2,25.8,27.8,32.7,51.3,74.7min,供試品中其他成分不干擾樣品測定,如圖1所示。
2.5 線性關系考察
精密吸取2.2項混合對照品貯備液0.3,0.75,1.5,3,4mL定容至5n正量瓶中,70%乙腈稀釋至刻度,即得系列濃度的對照品溶液,取混合對照品貯備液和系列濃度的對照品溶液按2.1項下色譜條件測定,以質量濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y)進行回歸,繪制標準曲線,結果見表1,可知6種有效成分在一定質量濃度范圍內線性關系良好。
2.6 精密度實驗
精密吸取2.2項混合對照品溶液4n止至5 mL量瓶中,70%乙腈定容至刻度,按2.1項下色潛條件連續(xù)進樣5次,結果綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸、熊果酸峰面積的RSD分別為2.67%,2.89%,0.18%,0.21%,0.33%,1.19%,表明儀器精密度良好。
2.7 穩(wěn)定性實驗
按處方量稱取相應量的甘露飲中藥材,按2.3項方法制備供試品溶液,按2.1項下色譜條件分別于0,3,6,9,12,24 h測定,結果綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸、熊果酸峰面積的RSD分別為3.00%,2.87%,1.60%,0.84%,3.23%,0.98%,表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定性良好。
2.8 重復性實驗
按處方量稱取相應量的甘露飲中藥材,共6份,按2.3項方法制備供試品溶液,按2.1項下色譜條件測定,結果綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸、熊果酸峰面積的RSD分別為1.89%,2.67%,1.08%,0.24%,2.64%,3.01%,表明該方法重復性良好。
2.9 加樣回收試驗
精密稱取甘露飲浸膏0.05g,共9份,分別置于9個5mL量瓶中,用70%乙腈定容,分別按已知含有量的80%、100%、120%3個水平加入混合對照品溶液,每個水平3份,按2_1項下色譜條件測定,計算回收率,見表2。結果綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃琴苷、甘草酸、熊果酸的加樣回收率平均值在96.12%~101.82%,RSD在1.72%~2.92%。表明該方法回收率良好。
2.10 甘露飲提取工藝優(yōu)化
2.10.1 提取溶劑的選擇
按處方量稱取相應量的甘露飲中藥材,粉碎過10目篩。稱取甘露飲粗粉,分別采用純水、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇各500mL,連續(xù)提取2次,每次2h,提取液旋轉蒸發(fā)濃縮后噴霧干燥。分別取干燥后粉末0.1g,加入70%乙腈定容至10mL,按2.1項色譜條件分別測定干粉中綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸、熊果酸含量。結果表明60%乙醇為提取溶劑所得干粉中六種有效成分含量均較高,本試驗選擇60%乙醇作為提取溶劑,進行正交試驗優(yōu)化工藝研究。
2.10.2 正交試驗設計
根據前期預實驗結果,選擇料液比、提取時間、提取次數為影響因素,實驗因素水平見表30每個因素選擇3個水平進行L9(34)正交試驗設計,以甘露飲中綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸和熊果酸的提取率作為評價指標,按2.1項下色譜條件測定提取干燥后樣品中6種有效成分峰面積,計算提取率,實驗設計方案與結果見表4,方差分析見表5。提取率=樣品峰面積際準品峰面積×100%。
由表4可知序號1效果最優(yōu),得到最優(yōu)條件是料液比1:4、提取時間1h、提取次數1次。方差分析結果表明提取時間對熊果酸、甘草酸、柚皮苷、綠原酸的提取含量影響顯著;黃芩苷的提取含量受料液比、提取時間、提取次數的影響相當;提取時間、提取次數對麥角甾苷的提取含量影響不顯著。料液比、提取時間對甘草酸的提取含量有顯著影響:料液比1:8、提取時間為1h得到甘草酸含量最多,即序號4為最優(yōu);提取次數對綠原酸含量有顯著影響:提取次數為1次,綠原酸含量最多,即第3因素下1水平為最優(yōu)方法。液料比、提取時間、提取次數對熊果酸、黃芩苷、抽皮苷、麥角甾苷提取含量影響并不顯著。
綜合以上實驗結果,最佳提取工藝條件是:甘露飲提取溶劑為60%乙醇,料液比1:4、提取時間為1h,提取次數為1次。
2.10.3 驗證試驗
根據正交實驗篩選出來的最佳提取工藝制備3批噴霧干燥供試品,按2.1項下色譜條件進行測定,結果3批供試品中綠原酸平均含量為8.56μg/g(RSD=2.52%);麥角甾苷平均含量為16.85μg/g(RSD=2.88%);黃芩苷平均含量為266.46μg/g(RSD=2.65%);柚皮苷平均含量為173.86μg/g(RSD=2.08%),甘草酸平均含量為14.33μg/g(RSD=2.52%),熊果酸平均含量為14.85μg/g(RSD=3.00%)。6種有效成分含量RSD均在3%以內,表明工藝穩(wěn)定可行。
3 結束語
試驗考察了甲醇、乙腈、緩沖鹽種類和濃度對樣品分離的影響,最后確認乙腈和0.1磷酸溶液進行梯度洗脫后,各色譜峰分離度好,保留時間適中,基線穩(wěn)定,綠原酸、黃芩苷、甘草酸和熊果酸峰型和分離度均較好,而麥角甾苷與柚皮苷由于自身化學性質和方劑中含量差異的影響,能實現基線分離。經過方法學考察試驗,本文建立的含量檢測方法準確、可靠,重復性好,可用于同時測定甘露飲中多種物質的含量,為甘露飲質量控制及綜合評價提供了借鑒。
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(編輯:徐柳)