病變紅細胞的原子力顯微鏡顯微觀察測試

郭志峰

(神華準能資源綜合開發(fā)有限公司 研發(fā)中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 010300)

人體血液中主要的細胞為紅細胞，因此紅細胞的形態(tài)對血液維持人體正常的生理機能有著非常重要的影響[1]。血液中紅細胞的形態(tài)特征及其體積、容積等細胞病理變化是對某些疾病診斷和研究的重要依據(jù)[2,3]。正常紅細胞的形態(tài)為中央凹陷的圓盤狀，邊緣較厚，直徑約5～8μm，細胞膜表面呈光滑狀。在病理狀況下，紅細胞的顯微形態(tài)在致病因素影響下會發(fā)生變化，如棘狀紅細胞增多癥所導致的紅細胞形狀變異為表面長滿突起的棘狀。紅細胞對其微環(huán)境的變化非常敏感，當細胞內(nèi)離子濃度，ATP和膜骨架蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時，細胞的形態(tài)就會發(fā)生改變，當人體受到某些疾病侵害時可導致紅細胞膜脂質(zhì)雙層的蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，從而使其發(fā)生病理改變，因而可以通過觀察紅細胞的顯微形態(tài)為某些疾病的診斷提供重要依據(jù)[4,5]。目前，可以用于生物細胞顯微形態(tài)的觀察儀器主要有光學顯微鏡、掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡等。光學顯微鏡操作簡便易行，應(yīng)用范圍廣，但光學顯微鏡由于可見光波長的限制，分辨率低，不能清晰地觀察到紅細胞的顯微形態(tài)及細胞膜的表面細微狀態(tài)，因而其應(yīng)用受到了很大的限制。掃描電子顯微鏡是應(yīng)用非常廣泛的顯微形貌觀察儀器，但由于掃描電鏡主要適合于觀察導電性良好的樣品，對于人體紅細胞這種導電性非常差的樣品來說，即使對其進行噴金鍍膜處理后，其觀察效果也非常不好，同時由于掃描電鏡不能測量紅細胞表面的粗糙度數(shù)據(jù)，因而其不能對紅細胞膜表面的平整度進行評價。原子力顯微鏡(AFM)是通過探針與被測樣品之間的微弱相互作用力即原子力來獲得物質(zhì)表面形貌的信息。AFM能夠在真空、空氣或溶液環(huán)境中直接對生物大分子等生物材料進行測試，獲得直觀的三維形貌和尺寸信息，并具有納米級別的分辨率；能夠在近生理的環(huán)境中對生物樣品進行納米級測試和操縱，對其活性過程進行跟蹤觀察[6-8]，因此在生物結(jié)構(gòu)的研究中具有獨特的優(yōu)勢，目前已被廣泛應(yīng)用于多肽、DNA、核酸、蛋白質(zhì)、微生物、細胞、透明質(zhì)酸等各種生物材料顯微結(jié)構(gòu)的觀察研究[9-15]，然而其專門用于人體血液中紅細胞顯微形態(tài)的測試研究方面的報道還非常少。本文專門采用AFM分別對人體正常和各種病變的紅細胞顯微形態(tài)進行了對比測試研究，以期為因紅細胞變異所導致的人體某些疾病的快速診斷提供可靠的依據(jù)。

1 樣品制備方法與儀器測試條件

1.1 樣品制備方法

實驗所需血樣均由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液科提供,分別取自新鮮抗凝正常人體血液和棘形紅細胞、口形紅細胞、靶形紅細胞增多癥等病變血液各1.0mL，按1:1比例直接滴入等量的固定液(4%多聚甲醛-2.5%戊二醛),4℃固定1h，然后低速離心5min,棄去上清液，用0.1mol/L磷酸緩沖液漂洗并重新離心去上清液3次，而后依次用50%、70%、90%的無水乙醇梯度脫水，吹散后，用滴管取含有紅細胞的乙醇溶液滴在預先處理好的蓋玻片上(蓋玻片上覆蓋一層Formvar膜)，氮氣吹干后待測。

1.2 儀器與測試條件

原子力顯微鏡測試采用德國布魯克公司生產(chǎn)的Dimension Edge型原子力顯微鏡，測試采用輕敲模式，在空氣環(huán)境中進行測試，探針采用針尖曲率半徑為8nm，力常數(shù)為40N/m，共振頻率為331.179kHz的硅探針，掃描范圍分別為20×20μm、10×10μm、1×1μm，掃描頻率為0.5Hz。

2 實驗結(jié)果

2.1 原子力顯微鏡對正常紅細胞的測試結(jié)果

圖1、圖2分別為單個和多個人體正常紅細胞的AFM顯微三維圖像，從圖中可以看到人體血液中正常的紅細胞形態(tài)均勻，呈中央雙凹的圓盤形，中央較薄，邊緣較厚，細胞膜表面光滑。圖1右側(cè)部分為通過NanoScope分析軟件在左側(cè)單個紅細胞上面沿著紅線處所拉取的截面線，從截面線數(shù)據(jù)可以得出單個人體正常紅細胞的直徑在7.8μm左右，中央凹陷部分深度在1.3μm左右。通過NanoScope分析軟件對圖2中所測到的6個正常紅細胞尺寸進行統(tǒng)計后得出其平均直徑為7.5μm，中央凹陷部分平均深度為1.5μm。通過讓探針精確定位到紅細胞膜表面進行小范圍精細掃描可以得到紅細胞膜表面的顯微結(jié)構(gòu)三維圖(圖3)，通過NanoScope分析軟件可以得到所測區(qū)域的平均粗糙度值為3.03nm，均方根粗糙度值為3.68nm。從圖3和粗糙度數(shù)據(jù)可以看到人體正常紅細胞表面均由形態(tài)均勻的納米小顆粒組成，表面極其光滑，這與Zhang等[16]的測試結(jié)果所一致，這也可以證實此測試方法的可靠性。

圖2 多個正常紅細胞的AFM三維形貌圖

Fig.2 The 3D image of multiple normal erythrocytes

圖3 正常紅細胞細胞膜表面局部放大三維形貌圖

Fig.3 The 3D image of erythrocyte membrane surface

2.2 原子力顯微鏡對棘形紅細胞的測試結(jié)果

圖4左側(cè)部分為人體病變血液中棘形紅細胞變形初期的AFM顯微三維圖像，圖4右側(cè)部分為通過NanoScope分析軟件在左側(cè)單個紅細胞上面沿著紅線處所拉取的截面線，從圖中可以看到棘形紅細胞在變形初期其直徑大小并未發(fā)生明顯的變化，而其中央凹陷部分則在逐漸上翻，在細胞膜表面開始逐漸長出小的凸起，隨著中央凹陷部分的逐漸上翻和凸起的逐漸長大(如圖5a所示)，最后完全變?yōu)榧渭t細胞(如圖5b所示)。圖6為多個棘形紅細胞的AFM三維形貌圖，從圖中也可以看到從正常紅細胞到棘形紅細胞是一個逐步變形的過程。通過讓探針精確定位到變形初期的棘形紅細胞膜表面進行小范圍精細掃描可以得到變形初期的棘形紅細胞膜表面的顯微結(jié)構(gòu)三維圖(圖7)，通過NanoScope分析軟件可以得到所測區(qū)域的平均粗糙度值為3.61nm，均方根粗糙度值為4.40nm。從圖7可以看到變形初期的棘形紅細胞膜表面形貌與正常紅細胞膜表面形貌有很大的不同，細胞膜表面的納米小顆粒開始膨脹變大，這也就可以從微觀角度解釋棘形紅細胞棘形凸起生成的原因，粗糙度數(shù)據(jù)也表明棘形紅細胞表面粗糙度比正常紅細胞表面粗糙度要大，從這一點也可以說明棘形紅細胞在變形初期其細胞膜表面的微觀結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生了變化。通過NanoScope分析軟件得到變形中期和完全變形后的棘形紅細胞膜表面的平均粗糙度值分別為10.31nm和70.64nm，這說明隨著紅細胞的變形，其膜表面逐漸變得粗糙。紅細胞微觀結(jié)構(gòu)的改變表明紅細胞的生理性質(zhì)發(fā)生了改變，紅細胞的彈性和變形能力以及運載氧的能力也肯定會受到影響。

(a)

(b)

圖5 單個棘形紅細胞變形中期(a)和完全變形后(b)的AFM三維形貌圖

Fig.5 The 3D image of single acanthocyte in the middle (a) and last (b) stage of deformation

圖6 多個棘形紅細胞的AFM三維形貌圖

Fig.6 The 3D image of multiple acanthocytes

圖7 棘形紅細胞細胞膜表面局部放大三維形貌圖

Fig.7 The 3D image of acanthocyte membrane surface

2.3 原子力顯微鏡對口形紅細胞的測試結(jié)果

圖8、圖9分別為單個和多個人體病變血液中口形紅細胞的AFM顯微三維圖像，從圖中可以看到口形紅細胞變形嚴重，分裂為多層圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)。圖8右側(cè)部分為通過NanoScope分析軟件在左側(cè)單個紅細胞上面沿著紅線處所拉取的截面線，可以得出變異后紅細胞的直徑在9.0μm左右，中央凹陷部分深度在1.4μm左右。通過NanoScope分析軟件對圖9中所測到的4個口形紅細胞尺寸進行統(tǒng)計后得出其平均直徑為9.2μm，中央凹陷部分平均深度為1.3μm。從以上數(shù)據(jù)可以看到變異后的紅細胞其直徑稍微變大，中央凹陷部分逐漸縮小為扁口形。通過讓探針精確定位到口形紅細胞膜表面進行小范圍精細掃描可以得到口形紅細胞膜表面的顯微結(jié)構(gòu)三維圖(圖10)，通過NanoScope分析軟件可以得到所測區(qū)域的平均粗糙度值為42.3nm，均方根粗糙度值為52.2nm。從圖10可以看到口形紅細胞膜表面微觀形貌與正常紅細胞膜表面微觀形貌完全不同，膜表面也開始分裂為小的環(huán)形結(jié)構(gòu)，這說明口形紅細胞分裂為多層圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)是一個逐步分裂的過程，由于細胞表面的分裂造成其表面的粗糙度急劇上升。

圖9 多個口形紅細胞的AFM三維形貌圖

Fig.9 The 3D image of multiple stomatocytes

圖10 口形紅細胞細胞膜表面局部放大三維形貌圖

Fig.10 The 3D image of stomatocyte membrane surface

2.4 原子力顯微鏡對靶形紅細胞的測試結(jié)果

圖11、圖12分別為單個和多個人體病變血液中靶形紅細胞的AFM顯微三維圖像，從圖中可以看到靶形紅細胞仍呈圓盤狀，但其變形嚴重，分裂為多層圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)，凹陷中央有圓拱形凸起，通過NanoScope分析軟件在圖11左側(cè)單個紅細胞上面沿著紅線處拉取截面線，可以得到變異后的靶形紅細胞直徑在9.7μm左右，中央凹陷部分深度在0.7μm左右。通過NanoScope分析軟件對圖12中所測到的4個正常紅細胞尺寸進行統(tǒng)計后得出其平均直徑為10.2μm，中央凹陷部分平均深度為0.5μm。從以上數(shù)據(jù)可以看到變異后的紅細胞其直徑稍微變大，中央凹陷部分逐漸上翻形成圓拱形凸起。通過讓探針精確定位到靶形紅細胞膜表面進行小范圍精細掃描可以得到靶形紅細胞膜表面的顯微結(jié)構(gòu)三維圖(圖13)，通過NanoScope分析軟件可以得到所測區(qū)域的平均粗糙度值為11.1nm，均方根粗糙度值為13.2nm。從圖13可以看到靶形紅細胞膜表面微觀形貌與正常紅細胞膜表面微觀形貌完全不同，膜表面也開始分裂為小的環(huán)形結(jié)構(gòu)，這說明靶形紅細胞分裂為多層圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)也是一個逐步分裂的過程，由于細胞表面的分裂造成其表面的粗糙度急劇上升。

圖12 多個靶形紅細胞的AFM三維形貌圖

Fig.12 The 3D image of multiple target erythrocytes

圖13 靶形紅細胞細胞膜表面局部放大三維形貌圖

Fig.13 The 3D image of target erythrocyte membrane surface

3 結(jié) 論

通過原子力顯微鏡對人體血液中正常紅細胞和病變紅細胞的比較測試研究發(fā)現(xiàn)，原子力顯微鏡具有非常高的分辨率。既可以用于紅細胞的整體三維形貌成像，可以清晰地觀察到正常紅細胞和病變紅細胞不同的顯微形態(tài)，并可以對正常紅細胞和病變紅細胞的整體三維尺寸進行精確測量，這可為人體血液中紅細胞疾病的快速診斷提供可靠的依據(jù)；又可以對紅細胞細胞膜表面的顯微結(jié)構(gòu)進行三維成像并測量細胞膜表面的粗糙度數(shù)據(jù)，從而為人體血液中紅細胞疾病的病理研究提供依據(jù)。與紅細胞形態(tài)改變相關(guān)的疾病包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、感染性疾病等部分疑難診斷的病例，當常規(guī)檢驗方法難以確診時，原子力顯微鏡檢查可以提供重要的病理診斷依據(jù)。該測試手段完全可以用于紅細胞形態(tài)相關(guān)的疾病的快速診斷與病理研究,還可以應(yīng)用于醫(yī)學其它類似領(lǐng)域。