徐珂　張麗萍　張園園　劉俊果

摘 要：針對抗菌肽的生物活性、重組表達(dá)系統(tǒng)以及分子改造設(shè)計進(jìn)行了回顧總結(jié)，提出了抗菌肽研究及技術(shù)開發(fā)領(lǐng)域目前存在的問題， 包括抗菌活性較弱、生物合成效率不高、選擇性差等。同時提出分子改造是提高抗菌活性和選擇性的有效策略，而優(yōu)化重組表達(dá)系統(tǒng)是提高生物合成效率的關(guān)鍵途徑。認(rèn)為針對抗菌肽的研究和開發(fā)，一方面會深化人類對于抗菌肽的結(jié)構(gòu)與抗菌性、選擇性、毒性關(guān)系的認(rèn)識，深化對重組表達(dá)系統(tǒng)關(guān)鍵步驟及調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識，具有顯著的科學(xué)意義;另一方面，由于抗菌肽獨特的抗菌機(jī)制，不易產(chǎn)生耐藥性，對抗菌肽的研發(fā)將會大大推動其在藥品、食品、化妝品、飼料等領(lǐng)域的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)工程;抗菌肽;生物活性;表達(dá)系統(tǒng);重組表達(dá);分子改造

中圖分類號：Q816 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.7535/hbkd.2019yx05011

Advances in microbial antimicrobial peptides expression

system and transformation strategy

XU Ke1， ZHANG Liping2， ZHANG Yuanyuan1， LIU Junguo1

（1. School of Bioscience and Bioengineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang， Hebei 050018， China;2. Institute of Biology， Hebei Academy of Sciences， Shijiazhuang， Hebei 050081， China）

Abstract：In this paper， a review on antimicrobial peptides， including the bioactivity， recombinant expression system and molecular transformation strategy， is provided. The main problems in the fields of antimicrobial peptides are put out，including low antibacterial activity， small productivity， and weak selectivity. It is considered that molecular structure modification is a valid strategy to enhance its antibacterial activity and selectivity. Optimization of recombinant expression system would be the key way to improve productivity. On one hand， the research and development on antibacterial peptides will strengthen the knowledge on the relationship between structure and function， including selectivity， antibacterial activity and toxicity， and the regulation strategies on gene expression system， both of which show significant scientific importance. On the other hand， antimicrobial peptides seldom shows drug resistance because of its antibacterial mechanism， and the research and development on antibacterial peptides will promote greatly its application in the fields of food， pharmaceuticals， cosmetics， and feed industry， etc.

Keywords：protein engineering; antimicrobial peptides; biological activity; expression system; recombinant expression; molecular transformation

抗生素依賴于單一酶參與的代謝調(diào)控途徑，容易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，長期服用會引起機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性[1]。抗菌肽（antimicrobial peptides，AMP）作為生物合成的先天免疫成分，憑借其種類多樣、安全無害而被認(rèn)為是傳統(tǒng)抗生素的替代品[2]，具有熱穩(wěn)定性、耐受性、pH值穩(wěn)定性、消化酶穩(wěn)定性等生物學(xué)特性。抗菌肽是一類攜帶正電荷、具有廣譜抗菌能力且不易產(chǎn)生抗藥性的小分子多肽類物質(zhì)[3]，大部分抗菌肽分子質(zhì)量小，由12～50個氨基酸殘基組成，具有兩親性特征[4]，部分抗菌肽具有靶向性?？咕脑谧匀唤缰蟹植紡V泛，原核和脊椎動物體內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)[5]，同時在線數(shù)據(jù)庫（http：//aps.unmc.edu/AP/main.php）共記錄有2 971種抗菌肽，主要來源于動植物、細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌和原生生物，按其結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行分類，主要有α-螺旋類、β-折疊類、片層結(jié)構(gòu)類和環(huán)狀結(jié)構(gòu)類抗菌肽[6]。

目前，獲得抗菌肽的方法主要有直接提取法、化學(xué)合成法以及基因工程法。從生物體內(nèi)直接分離、純化得到的抗菌肽濃度低，操作程序復(fù)雜，成本高，工藝流程中的強酸、強堿和有機(jī)溶劑會產(chǎn)生較大的污染。而化學(xué)合成法不僅成本高、耗時長，合成目標(biāo)肽的結(jié)構(gòu)和生物活性也得不到保證?；蚬こ谭ㄒ呀?jīng)成為獲取抗菌肽的主要途徑之一，除少數(shù)采用動植物表達(dá)系統(tǒng)外，其余大部分均采用細(xì)菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)。研究能夠高效表達(dá)、并且對宿主無抑制作用的微生物表達(dá)系統(tǒng)及其改造成為近年來抗菌肽領(lǐng)域的重點。本文對不同微生物來源的抗菌肽及其生物活性、靶向性、重組表達(dá)系統(tǒng)、分子改造設(shè)計的研究進(jìn)行綜述，以期為今后抗菌肽的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 抗菌肽的生物活性及靶向性

抗菌肽的抗菌機(jī)制主要是其自身結(jié)構(gòu)與細(xì)菌細(xì)胞膜上的離子產(chǎn)生靜電作用，通過相互吸引與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，抗菌肽轉(zhuǎn)化為二級結(jié)構(gòu)，平行或垂直于細(xì)胞膜，再通過毯式模型（Carpet model）、桶板模型（Barrel-stave model）或環(huán)形孔洞模型（Torodial pore model）穿透細(xì)胞膜（見圖1），形成的這種離子通道使膜內(nèi)的大量內(nèi)容物外流，從而發(fā)揮抑菌作用。除此之外，抗菌肽還具有抵抗真菌和病毒的活性，對腫瘤細(xì)胞、原生生物和寄生蟲均有殺傷破壞能力，同時具有抗內(nèi)毒素、促進(jìn)傷口愈合等免疫調(diào)節(jié)活性。

盡管抗菌肽優(yōu)點眾多，但自身的一些特性仍然限制了其應(yīng)用的范圍。

抗菌肽具有一定的溶血性，在高濃度的環(huán)境中，陽離子抗菌肽會與帶有負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜產(chǎn)生接觸。在動物細(xì)胞環(huán)境中，抗菌肽能夠損傷哺乳動物細(xì)胞，造成細(xì)胞自溶。高濃度的抗菌肽對宿主細(xì)胞會產(chǎn)生抑制作用[7]，靶性抗菌肽的能夠克服對普通菌群包含宿主細(xì)胞

的抑制或殺傷作用，對目標(biāo)細(xì)菌的治療更具高效性。革蘭氏陰性菌的脂多糖（LPS）是細(xì)菌外壁層中特有的一種化學(xué)物質(zhì)，是細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分，是一類重要的信號分子。FRECER等[8]設(shè)計并合成了針對LPS的抗菌肽，屬于環(huán)狀陽離子多肽，對LPS和LA均有辨識能力;多肽含有相同的兩親性序列，能夠與LPS或LA結(jié)合，在Cys1—Cys19之間形成二硫鍵以及β-發(fā)夾結(jié)構(gòu);LPS-targeted及其擬肽對革蘭氏陰性菌有很好的選擇性作用。CHOU等[9]設(shè)計的抗菌肽GW-Q4，GW-Q6和GW-H1抑菌活性明顯高于天然抗菌肽magainin 2a與pleurocdin，人工設(shè)計合成的抗菌肽所具有的螺旋結(jié)構(gòu)能夠特異識別Vibriospp，為海洋病原菌提供了一類新的靶向藥物。

2 微生物源抗菌肽的重組表達(dá)系統(tǒng)

2.1 原核重組表達(dá)系統(tǒng)

原核表達(dá)系統(tǒng)是最早采用的表達(dá)系統(tǒng)。原核生物具有諸多優(yōu)點，能夠高效地將克隆載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而純化獲得目的蛋白。宿主菌主要有大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），常用的表達(dá)載體有pET，pTrc，pLex，pGEX，pQE等。

2.1.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最成熟的抗菌肽表達(dá)系統(tǒng)[10]。該系統(tǒng)在表達(dá)過程中具有一定的難度，大腸桿菌作為原核生物表達(dá)時容易形成包涵體，影響后期的分離和純化，需要進(jìn)行復(fù)性處理，系統(tǒng)也缺乏翻譯后的加工修飾系統(tǒng)。宿主細(xì)胞表達(dá)的抗菌肽產(chǎn)物會反饋抑制宿主細(xì)胞的增殖，從而影響到系統(tǒng)的表達(dá)量。大腸桿菌表達(dá)多為陽離子肽，本身具有大量的正電荷，對蛋白酶較敏感易造成酶解，而降低表達(dá)量，因此抗菌肽通常以融合蛋白的方式進(jìn)行表達(dá)，且具有生物活性[11]。

分子伴侶作為純化標(biāo)簽可以減少包涵體的形成，同時促進(jìn)目標(biāo)蛋白的可溶性表達(dá)。這些標(biāo)簽蛋白有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）[12]、麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）[13]、綠色熒光蛋白（GFP）[14]、小泛素相關(guān)修飾物（SUMO）[15]和硫氧化還原蛋白（Trx）[16]。GST標(biāo)簽相對分子質(zhì)量為26 kD[17]，可促進(jìn)融合蛋白的可溶性表達(dá)，若目標(biāo)蛋白為非水溶性蛋白，需先變性溶解后才能用GST親和柱純化。MBP標(biāo)簽相對分子質(zhì)量為40 kD[16]，使用時先用交聯(lián)淀粉親和層純化，再用專一性蛋白酶切割融合蛋白。GFP標(biāo)簽相對分子質(zhì)量為2.6 kD，當(dāng)GFP表達(dá)溫度高于30 ℃時，就能形成大量包涵體，因此可用來生產(chǎn)包涵體或融合蛋白表達(dá)的小分子蛋白標(biāo)簽[18]。SUMO標(biāo)簽相對分子質(zhì)量為12 kD，由于其分子質(zhì)量小，因而有利于保留抗菌肽的天然活性，增加目標(biāo)蛋白在融合蛋白中的比例，是一種新型的標(biāo)簽蛋白。除了上述標(biāo)簽蛋白被報道使用之外，NUSA（55 kD）、ubiquiti（UB，8 kD）等標(biāo)簽蛋白也被用于大腸桿菌系統(tǒng)的表達(dá)中。研究中發(fā)現(xiàn)一部分分子伴侶可以促進(jìn)包涵體的形成，這些蛋白標(biāo)簽主要包括PurF片段（16.3 kD）、PaP3.30（17.6 kD）和TAF12組蛋白折疊結(jié)構(gòu)域（8.4 kD）等。形成的包涵體能夠保護(hù)融合表達(dá)的抗菌肽，防止被降解而且可以進(jìn)行快速純化。

分子質(zhì)量小的抗菌肽增加了分離、純化和檢測的難度，串聯(lián)表達(dá)不僅適用于真核表達(dá)系統(tǒng)，還可彌補原核表達(dá)系統(tǒng)對目標(biāo)蛋白回收率低的不足，獲得的重組蛋白通過切割仍具有抑菌活性。如按密碼子使用頻率對抗菌肽Spinosan-C進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計合成8拷貝的串聯(lián)8×Spinosan-C基因，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a中進(jìn)行克隆，再在Rosetta中進(jìn)行原核表達(dá)，獲得重組蛋白，切割獲得的單體仍能抑制枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的生長[19]。

2.1.2 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)

枯草芽孢桿菌是一種表達(dá)穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低、無污染、在工業(yè)酶和飼用酶工業(yè)發(fā)酵中應(yīng)用廣泛、具有良好前景的基因工程受體菌。目前B.Subtilis168基因組已經(jīng)完成測序，相關(guān)基因組被發(fā)表，這為枯草芽孢桿菌菌株改造和工程菌的構(gòu)建提供了極大的幫助。與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)具有較強的蛋白分泌能力，可直接分泌到細(xì)胞體外，有利于收集、分離和純化目標(biāo)蛋白，大大降低了成本。如抗菌肽Fowlicidin-3在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)，抑菌實驗表明6種臨床分離菌株的MIC值為11～16 μg/mL[20]。但枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)過程中會分泌降解活性很強的蛋白酶，從而降低表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性，獲得的重組蛋白量小于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，適用的載體數(shù)量也少于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。目前，該系統(tǒng)主要用來防護(hù)和治療植物病害，對人類和動物疾病的應(yīng)用較少。

2.1.3 藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)

藍(lán)藻的遺傳背景簡單，對生長環(huán)境要求低，人工培育時對培養(yǎng)基的污染小，適合規(guī)模化生產(chǎn)，是一種具有微生物和植物優(yōu)點的基因工程的受體。應(yīng)用的表達(dá)宿主主要有魚腥藻、集胞藻、聚球藻和點形念球藻。其中hSM-CSF造血刺激因子是最早在藍(lán)藻系統(tǒng)中成功表達(dá)的外源蛋白。與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比，藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)不含內(nèi)毒素，不容易產(chǎn)出包涵體，便于純化。藍(lán)藻的優(yōu)勢明顯，可能成為比大腸桿菌與酵母等宿主更理想的表達(dá)系統(tǒng)[21]。

2.2 真核重組表達(dá)系統(tǒng)

真核表達(dá)系統(tǒng)主要有畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)與釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)兩大成熟系統(tǒng)，以及目前處于熱門的萊茵衣藻表達(dá)系統(tǒng)。酵母作為真核表達(dá)系統(tǒng)的主要宿主菌，包括畢赤酵母（Pichia pastoris）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）和多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha）等，表達(dá)載體有pPIC9K，pPIC3.5，pGAPZa，pPICZa等。酵母表達(dá)系統(tǒng)得益于酵母單細(xì)胞真菌的特性，具有繁殖速度快、基因組小的特點，表達(dá)產(chǎn)物能夠糖基化、分泌表達(dá)，并且表達(dá)量高，可彌補原核系統(tǒng)不能進(jìn)行蛋白折疊和翻譯后修飾的不足，使獲得的目標(biāo)蛋白更容易純化，操作簡單，生產(chǎn)成本低，適用于大批量發(fā)酵工藝，是一種具有商業(yè)價值的真核表達(dá)系統(tǒng)。

2.2.1 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)

外源線性DNA通過同源重組可直接整合到畢赤酵母基因組以獲得穩(wěn)定遺傳的菌株[22]，不僅擁有高效表達(dá)的啟動子，還能將表達(dá)的目標(biāo)蛋白分泌到胞外，便于后續(xù)的分離純化[23]，并且具有產(chǎn)量高和遺傳穩(wěn)定的特點，至今有500多種外源蛋白在該系統(tǒng)中獲得高效表達(dá)。如利用畢赤酵母密碼子的偏愛性，人工合成多聚陽離子抗菌肽與多聚陰離子抗菌肽的DNA序列，并將其克隆到pPIC9表達(dá)載體上，將表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-PCAP在GS115中，利用0.5%（體積分?jǐn)?shù)）的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)多聚陽離子抗菌肽（poly-cationic antibacterialpeptide，PCAP）[24]。但甲醇易爆、有一定毒性，在用甲醇做誘導(dǎo)劑時存在危險性。與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母自身含有過氧化物酶，不會隨著表達(dá)目標(biāo)蛋白的增加而對自身產(chǎn)生毒害作用。如HD5α對原核宿主菌有毒害作用，而在畢赤酵母中可高效表達(dá)[25]。與釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達(dá)的外源蛋白不易過度糖基化，抗原性相對較弱，更適合臨床應(yīng)用。

2.2.2 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)

釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)已有30多年的研究歷史，不僅具有真核重組表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點，還是一種安全、無污染、能使用強啟動子獲得高表達(dá)量的真核表達(dá)系統(tǒng)。真核表達(dá)質(zhì)粒M-pYES2-α-LfcinB在釀酒酵母宿主菌INVScl中的高效表達(dá)，為葡萄糖抑制效應(yīng)提供了實驗基礎(chǔ)。但釀酒酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生乙醇，會影響菌群數(shù)量，使目標(biāo)蛋白產(chǎn)量下降[26]，且表達(dá)質(zhì)粒不穩(wěn)定、外源蛋白易于過度糖基化、分子質(zhì)量大的外源蛋白表達(dá)效率低、信號肽加工不完全等，這些都限制了其規(guī)模化生產(chǎn)。

2.2.3 萊茵衣藻表達(dá)系統(tǒng)

萊茵衣藻作為一種單細(xì)胞、帶有鞭毛的真核生物，其生長周期短、生長迅速，并且培養(yǎng)條件簡單、光合效率高，有著“光合酵母”之稱。其生物學(xué)特性是可以短時間內(nèi)獲得大量遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因后代，并為遺傳學(xué)分析提供便利條件。目前多采用表達(dá)基因串聯(lián)得到重組質(zhì)粒，進(jìn)行異源表達(dá)，且表達(dá)量占據(jù)細(xì)胞蛋白總量的0.31%。與釀酒酵母和畢赤酵母相比，萊茵衣藻表達(dá)穩(wěn)定，如MytichA在pBluescriptⅡ SK+上進(jìn)行三片段串聯(lián)后構(gòu)建的載體在細(xì)胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達(dá)，這一結(jié)果為抗菌肽的獲取以及具有抗菌活性的餌料藻的生產(chǎn)和應(yīng)用提供了新途徑[27]。

3 抗菌肽的分子改造設(shè)計

3.1 替換氨基酸殘基

替換氨基酸殘基是一種高效、簡單的分子改造設(shè)計方法，在保證原有天然抗菌肽結(jié)果的基礎(chǔ)上，對某些位置的氨基酸進(jìn)行替換，從而改變其理化性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)，可獲得活性較高的新型抗菌肽衍生物[28]。增加抗菌肽母肽序列中色氨酸（Trp）的比例，可提高其抗G-的活性[29-30]。將天然抗菌肽chensinin-1序列中的甘氨酸（Gly）替換成Trp，即為突變體MC1-1。研究發(fā)現(xiàn)，MC1-1對部分菌種的MIC值明顯下降，突變體MC1-3在MC1-1基礎(chǔ)上將組氨酸（His）替換成精氨酸（Arg），其MIC值高于MC1-1[31]。對抗菌肽多肽鏈上的氨基酸進(jìn)行替換，有利于揭示結(jié)構(gòu)和抑菌活性間的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明抗菌機(jī)理提供指導(dǎo)。

3.2 截取短序列抗菌肽

有些天然抗菌肽氨基酸分子質(zhì)量較大、數(shù)量多、成分復(fù)雜，影響后期的分離、純化和生產(chǎn)。對這些抗菌肽的結(jié)構(gòu)和活性進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，截取多肽鏈某一部分后，其抗菌活性并沒有降低，若只生產(chǎn)具有抗菌活性的多肽分子，不僅降低成本，也便于生產(chǎn)、提高產(chǎn)量。截取抗菌肽PMAP-36 N端16個氨基酸殘基后仍具有完美的兩親性。兩親性是衡量抗菌肽活性的重要參數(shù)之一，完美的兩親性對抗菌肽的活性有促進(jìn)作用，但細(xì)胞毒性也會相應(yīng)增加?？咕牡姆肿痈脑煲C合多個因素，才能在原有基礎(chǔ)上研制出優(yōu)良的抗菌肽[32]。

3.3 改變短肽的結(jié)構(gòu)參數(shù)

抗菌肽的電荷量和親、疏水性等理化參數(shù)對抗菌活性具有重要的調(diào)節(jié)作用。在一定范圍內(nèi)，增加抗菌肽攜帶的正電荷量，有利于增強抗菌肽的抗菌活性，但攜帶的正電荷過多會導(dǎo)致抗菌肽與磷脂頭部結(jié)合過牢，使其穿膜效率下降，抗菌肽的抗菌活性也隨之減弱。此外，疏水性和親水性的比例也影響抗菌肽的生物活性。疏水性過低，導(dǎo)致抗菌肽的脂親和能力下降，使得短肽遠(yuǎn)離疏水性的細(xì)胞膜;疏水性過高會使細(xì)胞毒性增強，并引起短肽自身發(fā)生聚合效應(yīng)，也會使抗菌活性下降。因此，要適當(dāng)增加抗菌肽的疏水性。在抗菌肽LGR16多肽鏈的親水面設(shè)計Arg，疏水面設(shè)計亮氨酸（Leu）和纈氨酸（Val），有助于降低其溶血活性[33]。對抗菌肽V13KL序列親、疏水性與抗菌活性關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，用疏水值高的Leu替換或減少疏水值低的丙氨酸（Ala）的比例，均可增加多肽鏈的疏水性，但疏水性越高，抗菌肽的溶血性也越高，因此要保持適當(dāng)疏水值，才能更好地利用抗菌肽的抗菌活性[34]。

3.4 合成雜合肽

對不同抗菌肽的功能區(qū)域和抗菌活性的研究發(fā)現(xiàn)，截取2種或2種以上抗菌肽的功能區(qū)域，然后進(jìn)行拼接，得到的新型雜合抗菌肽具有多種抗菌肽的優(yōu)點，且毒性小，抗菌活性高。如：抗菌肽Cecropin A的第1～8個氨基酸和Magainin2的第1～12個氨基酸進(jìn)行拼接后，不僅增加了表達(dá)的穩(wěn)定性，雜合肽的抗菌活性也得到了提高[35]。將Cecropin A和Cecropin B的第1～7個氨基酸分別與Melittin的第4～11個氨基酸拼接得到CAM和CBM，這兩種不同的雜合肽不僅具有原抗菌肽的特征，同時溶血活性也變?nèi)趿薣36]。將

抗菌肽bovine lactoferricin（LB）與progetrin（PG）的功能區(qū)域進(jìn)行拼接，得到的雜合肽LB-PG的細(xì)胞毒性下降，抗菌活性明顯變強[37]。

4 問題和展望

抗菌肽作為天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，對機(jī)體感染和炎癥有重要的預(yù)防和治療作用。圍繞抗菌肽的研究雖然有了很大發(fā)展，但是仍然存在一些問題。

1） 與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽的抗菌活性一般較弱。

2） 抗菌肽的生物合成效率不高。使用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)時，抗菌肽對宿主菌的蛋白酶敏感，容易被蛋白酶分解。真核表達(dá)系統(tǒng)雖然彌補了原核表達(dá)系統(tǒng)中蛋白折疊和翻譯修飾的不足，但酵母系統(tǒng)的制作周期較長，多拷貝和高表達(dá)量宿主菌的篩選有相當(dāng)?shù)碾y度，導(dǎo)致抗菌肽的生物合成效率難以提高。

3） 選擇性差，某些抗菌肽毒性較強。

隨著對抗菌肽結(jié)構(gòu)、功能的不斷深入了解，對抗菌肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子改造成為可能，降低抗菌肽的毒性以及增加抗菌肽對宿主的選擇性成為新的研究方向[38]。提高對細(xì)菌的選擇性以及對腫瘤的靶向性是目前抗菌肽研究的另一熱門領(lǐng)域。目前，抗腫瘤肽主要有線性AMPs、雜合腫瘤肽和人工合成的抗腫瘤肽、α-螺旋AMPs和β-折疊AMPs幾類。

抗菌肽具有良好、廣譜的抗菌活性，不易產(chǎn)生耐藥性，并且?guī)缀鯖]有副作用，可望成為抗菌、抗病毒和抗癌癥的新型藥物。此外，在食品、化妝品和飼料生產(chǎn)領(lǐng)域上的推廣應(yīng)用，也使抗菌肽展現(xiàn)出獨特的商業(yè)價值。因此，對抗菌肽的研發(fā)不僅具有突出的科學(xué)意義，而且具有廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)/References：

[1]JOHN J J， STEED L L. Antibiotic resistance： A clinical danger beyond 2013[J]. Journal of the South Carolina Medical Association， 2013， 109（2）： 54-58.

[2]HEE-KYOUNG? K， CHEOLMIN K， CHANG HO S， et al. The therapeutic applications of antimicrobial peptides （AMPs）： A patent review[J].Journal of Microbiology， 2017， 55（1）： 1-12.

[3]SUN Yazhou， ZHOU Yahui， LIU Xiao， et al. Antimicrobial activity and mechanism of PDC213， an endogenous peptide from human milk[J].Biochemical and Biophysical Research Communications， 2017， 484（1）： 132-137.

[4]TANIGUCHI M， OCHIAI A， KONDO H， et al. Pyrrhocoricin， a proline-rich antimicrobial peptide derived from insect， inhibits the translation process in the cell-free Escherichia coli protein synthesis system[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering， 2016， 121（5）： 591-598.

[5]LEE J K， PARK S C， HAHM K S， et al. A helix-PXXP-helix peptide with antibacterial activity without cytotoxicity against MDRPA-infected mice[J]. Biomaterials， 2014， 35（3）： 1025-1039.

[6]BARCHINGER S E， ADES S E. Regulated proteolysis： Control of the Escherichia coli σ（E）-dependent cell envelope stress response[J]. Subcellular Biochemistry， 2013， 66： 129-160.

[7]SONG J， ZHANG W， KAI M， et al. Design of an acid-activated antimicrobial peptide for tumor therapy[J]. Molecular Pharmaceutics， 2013， 10（8）： 2934-2941.

[8]FRECER V， HO B， DING J L. De novo design of potent antimicrobial peptides[J]. Antimicrobial Agents Chemotherapy， 2004， 48（9）： 3349-3357.

[9]CHOU H T， KUO T Y， CHIANG J C， et al. Design and synthesis of cationic antimicrobial peptides with improved activity and selectivity against Vibrio spp.[J]. International Journal Antimicrobial Agents， 2008， 32（2）：130-138.

[10]MUSA M， RADMAN M， KRISKO A. Decreasing translation error rate in Escherichia coli increases protein function[J]. BMC Biotechnology， 2016， 19（21）： 16-28.

[11]HERBEL V， SCHAFER H， WINK M. Recombinant production of snakin-2 （an antimicrobial peptide from tomato） in E. coli and analysis of its bioactivity[J]. Molecules， 2015， 20（8）： 14889-14901.

[12]SUN Yan， LI Qian， LI Zhi， et al. Molecular cloning， expression， purification， and functional characterization of palustrin-2CE， an antimicrobial peptide of Rana chensinensis[J]. Bioscience， Biotechnology， and Biochemistry， 2012， 76（1）： 157-162.

[13]陳愛春， 彭偉， 汪生鵬. 親和標(biāo)簽在重組蛋白表達(dá)與純化中的應(yīng)用[J]. 中國生物工程雜志，2012， 32（12）： 93-103.

CHEN Aichun， PENG Wei， WANG Shengpeng. Progress in the application of affinity tags for the expression and purification of recombinant proteins[J]. China Biotechnology， 2012， 32（12）： 93-103.

[14]SKOSYREV V S， KULESSKIY E A， YAKHNIN A V， et al. Expression of the recombinant antibacterial peptide sarcotoxin IA in Escherichia coli cells[J]. Protein Expression and Purification， 2003， 28（2）： 350-356.

[15]LI Jianfeng， ZHANG Jie， ZHANG Zhen， et al. SUMO mediating fusion expression of antimicrobial peptide CM4 from two joined genes in Escherichia coli[J]. Current Microbiology， 2011， 62（1）： 296-300.

[16]LI Baocun， ZHANG Shuangquan， DAN Wenbing， et al. Expression in Escherichia coli and purification of bioactive antibacterial peptide ABP-CM4 from the Chinese silk worm， Bombyx mori[J]. Biotechnology Letters， 2007， 29（7）： 1031-1036.

[17]LI Yifeng. Carrier proteins for fusion expression of antimicrobial peptides in Escherichia coli[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry， 2009， 54（1）： 1-9.

[18]SOUNDRARAJAN N， CHO H S， AHN B， et al. Green fluorescent protein as a scaffold for high efficiency production of functional bacteriotoxic proteins in Escherichia coli[J]. Scientific Reports， 2016， 6： 20661.

[19]劉悅，詹忠根，朱兵，等.棘胸蛙抗菌肽Spinosan-C的串聯(lián)表達(dá)與活性檢測[J].生物工程學(xué)報，2018，34（1）：132-139.

LIU Yue， ZHAN Zhonggen， ZHU Bing， et al. Tandem expression and activity determination of antibacterial peptide Spinosan-C from Paa spinosa[J].Chinese Journal of Biotechnology， 2018， 34（1）： 132-139.

[20]曲小露，張福欣，王述柏，等. 抗菌肽Fowlicidin-3在枯草芽孢桿菌中表達(dá)及活性研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017（18）： 143-146.

[21]BERLA B M， SAHA R， IMMETHUN C M， et al. Synthetic biology of cyanobacteria： Unique challenges and opportunities[J].Nucleic Acids Research， 2013： 10.3389/fmicb.2013.00246.

[22]VOGL T， GEBBIE L， PALFREYMAN RW， et al. Effect of plasmid design and type of integration event on recombinant protein expression in Pichia pastoris[J]. Applied and Environmental Microbiology ， 2018， 84（6）：1-37.

[23]XIANG La， WANG Qinhong， ZHOU Yuling， et al. High-level expression of a ZEN-detoxifying gene by codon optimization and biobrick in Pichia pastoris[J]. Microbiological Research， 2016， 193： 48-56.

[24]李青，周曉宏.新型生物防腐劑——多聚陽離子抗菌肽在畢赤酵母中的表達(dá)[J].食品科學(xué)，2013，34（5）：161-166.

LI Qing， ZHOU Xiaohong. Expression of polycationic antibacterial peptides in Pichia pastoris[J]. Food Science， 2013，34（5）： 161-166.

[25]WANG Aiping， WANG Song， SHEN Mingqiang， et al. High level expression and purification of bioactive human alpha-defensin 5 mature peptide in Pichia pastoris[J]. Applied Microbiology Biotechnology， 2009， 84（5）： 877-884.

[26]MATTANOVICH D， BRANDUARDI P， DATO L， et al. Recombinant protein production in yeasts [J].Methods in Molecular Biology， 2012， 824： 329-358.

[27]MU Feiyun， LI Hui， HU Zhangli. Expression of tandem repeat cecropin B in chlamydomonas reinhardtii and its antibacterial effect [J]. Progress in Biochemistry and Biophysics， 2012， 39（4）： 344-351.

[28]SUN Shiyu， ZHAO Guangxu， HUANG Yibing， et al. Enantiomeric effect of d-amino acid substitution on the mechanism of action of α-helical membrane-active peptides[J].International Journal of Molecular Sciences， 2018， 19（1）： 67.

[29]TRIPATHI A K， KUMARI T， TANDON A， et al. Selective phenylalanine to proline substitution for improved antimicrobial and anticancer activities of peptides designed on phenylalanine heptad repeat[J]. Acta Biomaterialia， 2017， 57： 170-186.

[30]SUN Yue， DONG Weibing， SUN Li， et al. Insights into the membrane interaction mechanism and antibacterial properties of chensinin-1b [J]. Biomaterials， 2015， 37： 299-311.

[31]BI Xiaonan， WANG Che， DONG Weibing， et al. Antimicrobial properties and interaction of two Trp-substituted cationic antimicrobial peptides with a lipid bilayer[J]. Journal of Antibiotics， 2014， 67（5）： 361-368.

[32]ZHAO Xueliang， SHI Zhenxia. Research progress in preparation and mechanism of antibactrerial peptids[J]. Food Research and Development， 2014， 35（1）：1-4.

[33]DONG Weibing， MAO Xiaonan， GUAN Yue， et al. Antimicrobial and anti-inflammatory activities of three chensinin-1 peptides containing mutation of glycine and histidine residues[J]. Scientific Reports， 2017， 7： 40228.

[34]馬清泉，董娜，曹艷萍，等. 利用精氨酸和纈氨酸設(shè)計新型α-螺旋抗菌肽[J].微生物學(xué)報，2011，51（3）：346-351.

MA Qingquan， DONG Na， CAO Yanping， et al. Rational design of α-helical antimicrobial peptides with Val and Arg residues [J]. Acta Microbiologica Sinica， 2011， 51（3）：346-351.

[35]CHEN Y， GUARNIERI M T， VASIL A I， et al. Role of peptide hydrophobicity in the mechanism of action of alpha-helical antimicrobial peptides[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy， 2007， 51（4）： 1398-1406.

[36]XU Xiaoxia， JIN Fengliang， YU Xiaoqiang，et al. High-level expression of the recombinant hybrid peptide cecropinA（1-8）-magainin2（1-12） with an ubiquitin fusion partner in Escherichia coli[J]. Protein Expression & Purification， 2007， 55（1）： 175-182.

[37]CAO Yu， YU Rongqing， LIU Yi， et al. Design， recombinant expression， and antibacterial activity of the cecropins-melittin hybrid antimicrobial peptides[J]. Current Microbiology， 2010， 61（3）： 169-175.

[38]FOX M A， THWAITE J E， ULAETO D O， et al. Design and characterization of novel hybrid antimicrobial peptides based on cecropin A， LL-37 and magainin Ⅱ[J]. Peptides， 2012， 33（2）： 197-205.