多重PCR快速檢測化妝品中三種致病菌的研究

楊英

【摘 要】目的：探討多重PCR快速檢測在化妝品中三種致病菌中的應用效果。方法：參考已有的大腸桿菌phoA基因、銅綠假單胞菌外膜蛋白基因oprL與金黃色葡萄球菌特異性序列Smal中引物，對化妝品中常見的常見的三種致病菌采用PCR進行檢測、分析。結果：多重PCR擴增結果顯示：根據(jù)篩選的3對特異性引物對3個標準菌株、3個混合標準菌株及6個污染菌株進行擴增，實驗中出現(xiàn)3對引物均能對應的菌株發(fā)生特異性結合，出現(xiàn)一條預期擴增長度一致的清晰的條帶，6株其他菌株均未出現(xiàn)增出條帶。結論：利用多重PCR快速檢測用于化妝品三種致病菌檢測中效果理想，值得推廣應用。

【關鍵詞】多重PCR;快速檢測;化妝品;致病菌;應用效果

【中圖分類號】R256.21【文獻標識碼】A【文章編號】1005-0019（2019）22--01

臨床研究表明：微生物指標是化妝品衛(wèi)生質量合格與否的重要影響因素[1]。我國《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中明確規(guī)定每克或每毫克化妝品中不得檢出糞便大腸菌群、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌[2]。本文以病例隨機對照展開，探討多重PCR快速檢測在化妝品中三種致病菌中的應用效果，報道如下。

1 資料與方法

1.1 儀器與設備 小型高速離心機（Eppendorf）、紫外分光光度計（METASH UV5200PC）、Mastercycler nexus GSX1梯度PCR儀（Eppendorf）、凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad）、細菌DNA提取試劑盒、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（廣州環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.2 引物的合成與設計 本研究中所需的引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物見表1。

1.3 方法 （1）RNA提取。取待測化妝品，加入500uL trizol充分混合均勻后加入氯仿0.2mL，15s劇烈震蕩，常溫下靜置2-3min，15min離心，離心力1825g，獲得三層液體（上層為水相、中間層與下層為有機相）。取RNA沉淀，轉移到新的EP管中，加入0.5mL異丙醇，混合均勻后放置在-20℃冰箱中，10min離心，離心力1194g獲得RNA沉淀。充分洗滌RNA，加入250uL DEPC與750uL乙醇，利用乙醇完成沉淀的沖洗，5min離心，離心力2315g，取沉淀放入工作臺上進行20min干燥。利用紫外分光度儀檢測RNA濃度并完成RNA提純（以Rnase作為空白對照），在A260下測定吸光度值。（2）PCR測定。多重PCR快速測定化妝品中三種致病菌。設定PCR反應條件：30℃，10min;42℃，30 min;99℃，5 min;5℃，5 min，連續(xù)進行35個循環(huán)，最后72℃下完成10min延長，β-actin為內對照[3]。

1.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS18.0軟件處理，計數(shù)資料行檢驗，采用n（%）表示，計量資料行t檢驗，采用（）表示，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

多重PCR擴增結果顯示：根據(jù)篩選的3對特異性引物對3個標準菌株、3個混合標準菌株及6個污染菌株進行擴增，實驗中出現(xiàn)3對引物均能對應的菌株發(fā)生特異性結合，出現(xiàn)一條預期擴增長度一致的清晰的條帶，6株其他菌株均未出現(xiàn)增出條帶，見圖1。

3 討論

近年來，多重PCR快速檢測在化妝品三種病菌檢測中得到應用，且效果理想。本研究中，實驗中出現(xiàn)3對引物均能對應的菌株發(fā)生特異性結合，出現(xiàn)一條預期擴增長度一致的清晰的條帶，6株其他菌株均未出現(xiàn)增出條帶，說明多重PCR能實現(xiàn)化妝品中三種病菌的檢測。化妝品微生物污染不僅會給企業(yè)帶來經(jīng)濟損傷，亦會嚴重危害人類的健康，通過多重PCR檢測方法能同時、快速、準確的實現(xiàn)化妝品中大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌測定，有助于提高化妝品的使用及安全。

綜上所述，利用多重PCR快速檢測用于化妝品三種致病菌檢測中效果理想，具有快速、特異性等優(yōu)點，值得推廣應用。

參考文獻

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刁巧虹，卞國志，王娟，等.奶牛乳房炎常見致病菌多重PCR檢測方法的建立[J].動物醫(yī)學進展，2017，38（12）：59-63.