黃春青 曹桂紅 祝晶 楊婷 許波

【摘 要】目的：建立測(cè)定復(fù)方小檗堿鞣酸蛋白膠囊中鹽酸小檗堿溶出度的方法。方法：采用高效液相色譜法，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以磷酸鹽緩沖液[0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液和0.05 mol·L-1 庚烷磺酸鈉溶液（1∶1），含0.2%三乙胺，并用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0]-甲醇（43∶57）為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為262 nm，進(jìn)樣量為10 μL。以醋酸鹽緩沖液（pH4.0）1000 mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為150 r·min-1，取樣時(shí)間為45 min，溫度為37 ℃。結(jié)果：鹽酸小檗堿在30.312 5～303.124 9 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系（r=1），回收率為99.36%（n=9，RSD=0.98%）。結(jié)論：本法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確、可靠，可用于復(fù)方小檗堿鞣酸蛋白膠囊中鹽酸小檗堿溶出度的測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】復(fù)方小檗堿鞣酸蛋白膠囊;高效液相色譜法;鹽酸小檗堿;溶出度

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.1?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A?【文章編號(hào)】1007-8517（2019）19-0023-04

Abstract：Objective?To develop the method for the dissolution determination of berberine hydrochloride in Compound Berberine Hydrochloride Tannalbin Capsules. Methods?HPLC method was used. Using octadecyl silane bonded silica as filler of chromatographic column， The mobile phase was made up of phosphate buffer [0.05 mol·L-1 potassium phosphate monobasic solution and 0.05 mol·L-1 sodium heptane-1-sulphonate solution （1∶1）， containing 0.2% triethylamine and adjusting pH value to 3.0 with phosphoric acid]- methanol （43∶57），the detection wavelength was 262 nm，and the volume of injection was 10 μL·1000 mL of Acetate buffer （pH 4.0） was used as solvent. The rotation speed was 150 r·min-1，the sampling time was 45 min and the temperature was 37 ℃.Results?Good linearity was shown for Berberine Hydrochloride in the concentration range of 30.312 5～303.124 9 μg·mL-1 （r=1）， The average recovery rate was 99.36%（n=9，RSD=0.98%）.Conclusion?The method is simple， accurate and reliable， and can be used to determination of the dissolution of berberine hydrochloride in Compound Berberine Hydrochloride Tannalbin Capsules.

Key?words：Compound Berberine Hydrochloride Tannalbin Capsules;HPLC;Berberine Hydrochloride; dissolution

復(fù)方小檗堿鞣酸蛋白膠囊（曾用名為瀉痢朗膠囊）是貴州泛德制藥有限公司獨(dú)家生產(chǎn)的止瀉藥，主要用于痢疾、急慢性腸炎等[1]?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為WS-10001-（HD-1111）-2002，該標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)樣品溶出度項(xiàng)目進(jìn)行控制[2]。溶出度作為仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一，其結(jié)果優(yōu)劣對(duì)藥效產(chǎn)生至關(guān)重要的影響，同時(shí)也能間接的反映制劑原輔料及工藝的變化情況。作者目前未查詢(xún)到有關(guān)復(fù)方小檗堿鞣酸蛋白膠囊溶出度的文獻(xiàn)報(bào)道，但查詢(xún)到以鹽酸小檗堿為溶出度評(píng)價(jià)指標(biāo)的相關(guān)文獻(xiàn)，測(cè)定方法主要有高效液相色譜法和紫外分光光度法[3-5]。鹽酸小檗堿對(duì)多種革蘭陽(yáng)性菌及革蘭陰性菌均有抗菌作用，對(duì)幽門(mén)螺旋桿菌有抑制作用，臨床上主要用于治療腸道感染、如腸胃炎等[6-7]。本研究中運(yùn)用高效液相色譜法對(duì)復(fù)方小檗堿鞣酸蛋白膠囊進(jìn)行溶出度檢測(cè)，測(cè)定其所含鹽酸小檗堿量，從而有效建立溶出度檢查項(xiàng)目，為復(fù)方小檗堿鞣酸蛋白膠囊的質(zhì)量控制提供參考。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?SOTAX溶出試驗(yàn)儀（瑞士SOTAX公司）;Thermo Ultimate3000高效液相色譜儀;島津LC-20A高效液相色譜儀; METTLER TOLEDO XS205電子天平;Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6×150 mm，5 μm）;Waters X Bridge C18色譜柱（4.6×150 mm，5 μm）;Thermo AcclaimTM C18色譜柱（4.6×150 mm，5 μm）。

1.2?試劑與試藥?鹽酸小檗堿對(duì)照品（110713-201814，中國(guó)食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)86.7%）、醋酸鈉（AR，成都金山化學(xué)試劑有限公司，20170810）、冰醋酸（AR，天津市富宇精細(xì)化工有限公司，20151002）、甲醇（HPLC，美國(guó)TEDIA，17080670）;復(fù)方小檗堿鞣酸蛋白膠囊（批號(hào)：18092012、19012011、18092021、18052012、18072011、17112011、18052011、17122011、17072012、18092011）均由貴州泛德制藥有限公司提供。方法學(xué)實(shí)驗(yàn)樣品批號(hào)為18092012。

2?方法與結(jié)果

2.1?色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)?用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以磷酸鹽緩沖液[0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液和0.05 mol·L-1 庚烷磺酸鈉溶液（1∶1），含0.2%三乙胺，并用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0]-甲醇（43∶57）為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為262 nm，進(jìn)樣量為10 μL。理論板數(shù)按小檗堿峰計(jì)算不低于3000，鹽酸小檗堿峰與相鄰峰之間的分離度應(yīng)符合要求。

2.2?溶出條件的優(yōu)選?查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版二部鹽酸小檗堿膠囊溶出度的測(cè)定方法[8]，采用溶出度與釋放度（通則0931第一法），轉(zhuǎn)速為每分鐘120轉(zhuǎn)，選取水、0.1 mol·L-1鹽酸溶液、醋酸鹽緩沖液（pH4.0）（取114 mL1冰醋酸用水稀釋至1000 mL，取20.5 mL，再稱(chēng)取醋酸鈉1.22 g，加水溶解并稀釋至1000 mL）、磷酸鹽緩沖液（pH6.6）（取磷酸二氫鈉1.74 g、磷酸氫二鈉2.7 g、氯化鈉1.7 g與0.2 g十二烷基硫酸鈉，加水使溶解成400 mL）為溶出介質(zhì)[3-6，9]。在5、10、15、20、30、45、60、90和120min取樣，計(jì)算鹽酸小檗堿的累積釋放量，繪制溶出曲線(xiàn)。如圖1所示。

從溶出曲線(xiàn)可以看出，醋酸鹽緩沖液（pH-4.0）和水的累積釋放量高于另外兩種介質(zhì)，但兩種介質(zhì)的累積釋放量均不高，最高的只有51%（120 min）。故選取醋酸鹽緩沖液（pH4.0）和水為介質(zhì)，采用溶出度與釋放度（通則0931第二法），轉(zhuǎn)速為每分鐘120轉(zhuǎn)進(jìn)行比較，在5、10、15、20、30、45、60、90和120min取樣，計(jì)算鹽酸小檗堿的累積釋放量，繪制溶出曲線(xiàn)。如圖1所示。

從溶出曲線(xiàn)可以看出，醋酸鹽緩沖液（pH-4.0）是各時(shí)間點(diǎn)累積釋放量最大的溶出介質(zhì)，且滿(mǎn)足漏槽條件，故選擇醋酸鹽緩沖液（pH4.0）作為溶出介質(zhì)，但漿法120轉(zhuǎn)的累積溶出量120min也只有76%，故采用溶出度與釋放度（通則0931第二法），轉(zhuǎn)速為每分鐘150轉(zhuǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在5、10、15、20、30、45、60、90和120min取樣，計(jì)算鹽酸小檗堿的累積釋放量，繪制溶出曲線(xiàn)，同時(shí)比較放置沉降籃與不放置沉降籃的累積釋放量。如圖1所示。從溶出曲線(xiàn)可以看出，采用漿法150轉(zhuǎn)，不放置沉降籃的是比較理想的溶出曲線(xiàn)。

最終選定的溶出條件為：取本品，照溶出度與釋放度測(cè)定法（通則0931第二法），以醋酸鹽緩沖液（pH4.0）為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為每分鐘150轉(zhuǎn)，依法操作，經(jīng)45min時(shí)，取溶液濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液;另取鹽酸小檗堿對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加溶出介質(zhì)溶解并定量稀釋成每1 mL中約含0.12 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按“2.1”條下色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算每粒中鹽酸小檗堿的溶出量。限度為標(biāo)示量的70%，應(yīng)符合規(guī)定。

2.3?專(zhuān)屬性試驗(yàn)?采用廠家提供的輔料，按處方進(jìn)行稱(chēng)量配制陰性樣品，按“2.1”條下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，陰性樣品未見(jiàn)吸收峰;測(cè)定樣品中鹽酸小檗堿峰與對(duì)照溶液中的保留時(shí)間一致，鹽酸小檗堿峰峰型良好，與相鄰峰分離度達(dá)到要求。如圖2所示。

2.4?線(xiàn)性?對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備：精密稱(chēng)取鹽酸小檗堿對(duì)照品0.027 97 g置20 mL量瓶中，加溶出介質(zhì)溶解并稀釋至刻度，即得。

精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0和5.0 mL置20 mL量瓶中，加溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，即得線(xiàn)性溶液1到7。分別吸取線(xiàn)性溶液1到7各10 μL注入液相色譜儀中，按“2.1”條下色譜條件測(cè)定峰面積，記錄色譜圖。以鹽酸小檗堿峰面積（A）為橫坐標(biāo)，鹽酸小檗堿對(duì)照品的濃度C（μg·L-1）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得鹽酸小檗堿回歸方程：C=1.980A+0.603（r=1），如圖3所示。表明鹽酸小檗堿在30.312 5～303.124 9 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5?穩(wěn)定性試驗(yàn)?按優(yōu)選出的方法制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，室溫下分別在0、1、2、4、6、8和12 h各精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL注入液相色譜儀中，按“2.1”條下色譜條件測(cè)定峰面積，記錄色譜圖，結(jié)果對(duì)照品溶液RSD為0.11%，供試品溶液RSD為0.13%。表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6?回收率試驗(yàn)?對(duì)照品貯備液的制備：精密稱(chēng)取鹽酸小檗堿原料（含量為84.32%）0.146 2 g置100 mL量瓶中，加溶出介質(zhì)溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

樣品溶液的制備：按處方精密稱(chēng)取除鹽酸小檗堿外的相當(dāng)于處方量80%、100%和120%的各原輔料置100 mL量瓶中，高、中、低3種濃度各精密加入上述對(duì)照品貯備液12 mL、10 mL和8 mL。加溶出介質(zhì)溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。高、中、低3個(gè)濃度樣品，各平行制備3份，共9份。結(jié)果鹽酸小檗堿回收率為99.36%（n=9，RSD=0.98%）。

2.7?耐用性試驗(yàn)?精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL注入液相色譜儀中，按“2.1”條下色譜條件測(cè)定峰面積，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算溶出量。比較了不同色譜柱、不同柱溫、不同流速、不同流動(dòng)相比列和不同儀器對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，各條件下，各色譜峰峰型良好，與相鄰峰分離度均達(dá)到要求，說(shuō)明該方法耐用性試驗(yàn)結(jié)果良好。

2.8?檢出限和定量限的測(cè)定?精密稱(chēng)取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，并稀釋制成不同濃度的對(duì)照品溶液，精密吸取各不同濃度的對(duì)照品溶液注入液相色譜儀中，按含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積，記錄色譜圖，以信噪比S/N≈10時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限、S/N≈3時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限。測(cè)得鹽酸小檗堿的檢出限和定量限分別為2.425 ng和7.275 ng。

2.9?樣品溶出度測(cè)定?按優(yōu)選出的溶出度方法測(cè)定10批次樣品的溶出度。結(jié)果見(jiàn)表1。

3?討論

3.1?測(cè)定結(jié)果?從10批樣品的測(cè)定結(jié)果可以看出，各批次樣品溶出度均大于限度70%，各批次6粒測(cè)定結(jié)果RSD不大，10批次樣品間RSD為5.98%，各批次間溶出行為基本一致，反應(yīng)了廠家各批次間原輔料及工藝等情況控制較好，批間差異小。

3.2?濾膜吸附?實(shí)驗(yàn)過(guò)程中考慮到濾膜吸附對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，比較了兩種纖維素濾頭（直徑13 mm，0.45 μm和直徑25 mm，0.45 μm）對(duì)鹽酸小檗堿的吸附影響，分別比較了去掉初濾液0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 mL樣品的測(cè)定結(jié)果，RSD分別為0.50%和0.45%，表明兩種纖維素濾頭對(duì)鹽酸小檗堿均沒(méi)有吸附。

3.3?沉降籃對(duì)溶出度的影響?本品溶出度測(cè)定結(jié)果與是否放置沉降籃有很大的關(guān)系，從圖1可以看出，放置了沉降籃的樣品溶出度測(cè)定值與未放置沉降籃的測(cè)定值在取樣時(shí)間點(diǎn)鹽酸小檗堿的溶出量相差約30個(gè)百分點(diǎn)，在測(cè)定過(guò)程中觀察到，放置沉降藍(lán)的樣品在取樣時(shí)樣品黏附成團(tuán)，一直滯留在沉降籃中，故其溶出受水流以及與攪拌槳相對(duì)位置的影響較大[10];未放置沉降籃的樣品剛投入溶出杯中時(shí)，漂浮在溶出介質(zhì)中，但所有樣品均在投入溶出杯中2～3 min時(shí)，囊殼崩解，內(nèi)容物逐漸分散在溶出介質(zhì)中，在取樣時(shí)間點(diǎn)時(shí)，沒(méi)有樣品黏附成團(tuán)現(xiàn)象，故其溶出受水流以及與攪拌槳相對(duì)位置的影響較小[10]，因此，本品在測(cè)定溶出度時(shí)不放置沉降籃較為科學(xué)合理。

3.4?結(jié)論?本文使用HPLC法對(duì)復(fù)方小檗堿鞣酸蛋白膠囊中鹽酸小檗堿的溶出度進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、可靠。本研究是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)提升課題內(nèi)容，該課題還對(duì)處方中的鹽酸小檗堿和其他3種成分進(jìn)行了含量控制，因此溶出度的色譜條件選擇含量測(cè)定的色譜條件，方便企業(yè)及相關(guān)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)后續(xù)的質(zhì)量監(jiān)控工作，本次研究為復(fù)方小檗堿鞣酸蛋白膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及產(chǎn)品質(zhì)量的提升奠定了基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-07-05?編輯：陶希睿）