尹 怡 趙 城 余 權(quán) 李麗春 劉書貴 單 奇 馬麗莎 鄭光明*

（1 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（廣州）/農(nóng)業(yè)部休閑漁業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州510380 2 廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所 廣州510030

我國是水產(chǎn)品生產(chǎn)大國，連續(xù)多年我國水產(chǎn)品生產(chǎn)總量居世界首位。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，養(yǎng)殖水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留問題日益突出，已成為社會(huì)關(guān)注的食品安全熱點(diǎn)問題之一。水產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留通常來源于兩個(gè)方面：一是養(yǎng)殖過程施用藥物來防治水產(chǎn)品的疫病和蟲害，二是在環(huán)境施用的農(nóng)藥隨雨水沖淋流入養(yǎng)殖水體。大部分農(nóng)藥具有親脂性特點(diǎn)，養(yǎng)殖水體中的農(nóng)藥被水產(chǎn)品富集并通過食物鏈蓄積。為保護(hù)人類健康，各國政府加強(qiáng)了水產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留的監(jiān)控，制定了嚴(yán)格的最高殘留限量。例如：日本政府制定的肯定列表制度中大部分農(nóng)藥的限量值為0.01 mg/kg。建立水產(chǎn)品中靈敏、可靠、多組分農(nóng)藥殘留同時(shí)檢測的技術(shù)十分必要。

多組分農(nóng)藥殘留分析一般采用氣相色譜（GC）[1-2]、液相色譜（LC）[3]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）[4-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）[8-11]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）[12-14]等。前處理過程多采用均質(zhì)振蕩[4，9]、加速溶劑萃?。ˋSE）[1-2]等技術(shù)提取，凝膠滲透色譜（GPC）[1-2，6-7]、固相萃取（SPE）[10]等技術(shù)凈化。分散固相萃取法（QuECh-ERS）具有快速、簡易、低價(jià)等特點(diǎn)，在蔬菜、水果的農(nóng)藥多殘留檢測中應(yīng)用廣泛[9-11]。近年來也用于測定動(dòng)物源性食品中的農(nóng)藥殘留[6-8]。QuEChERS方法在排除樣品基質(zhì)干擾和多殘留分析方面具有顯著優(yōu)勢，乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、C18和石墨化炭黑（GCB）等填料及其組合能有效去除基質(zhì)干擾，然而這些填料普遍存在價(jià)格高、用量大等缺點(diǎn)，不利于推廣和應(yīng)用。發(fā)展價(jià)格低廉、快速高效、凈化效果優(yōu)越的改良吸附劑的QuEChERS 方法顯得尤為重要。聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）是一種重要的人工合成材料，具有比表面積大，剛性強(qiáng)，耐酸堿，耐高溫，使用壽命長及非特異性吸附低等特點(diǎn)，目前尚未見在QuEChERS 技術(shù)中應(yīng)用。本文對QuEChERS 方法進(jìn)行改良，選擇體積分?jǐn)?shù)1%的乙酸-乙腈溶液為提取溶劑，PS-DVB 和PSA 為QuEChERS 分散吸附劑，采用LC-MS/MS測定，建立水產(chǎn)品中氯嘧磺隆、異丙草胺、嘧菌酯、咪酰胺、烯酰嗎啉、甲磺隆、三唑酮、噻嗪酮、唑螨酯、烯唑醇、多菌靈、噻菌靈和抑霉唑等13 種農(nóng)藥的分析方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備

API4000 三重四級桿質(zhì)譜儀，美國AB 公司；1200 型高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；旋渦混勻器，德國IKA 公司；超純水機(jī)，美國Millipore公司；TDL-5-A 型離心機(jī)，上海安亭公司；N-EVAP 24 型氮吹儀，美國Organomation 公司；振蕩器，德國IKA 公司。

1.2 主要材料與試劑

乙腈、甲醇和甲酸為色譜純，德國Merck 公司；PSA，天津Agela 公司；PS-DVB，蘇州賽分公司；氯嘧磺隆、異丙草胺、嘧菌酯、咪酰胺、烯酰嗎啉、甲磺隆、三唑酮、噻嗪酮、唑螨酯、烯唑醇、多菌靈、噻菌靈和抑霉唑等13 種標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr.Ehrenstorfer 公司；無水醋酸鈉和無水硫酸鎂（分析純），廣州化學(xué)試劑廠。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解并定容，配得質(zhì)量濃度約為1 000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-20 ℃以下保存，保存期6 個(gè)月。

準(zhǔn)確移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于棕色容量瓶中，用甲醇稀釋定容配制10 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，于-20 ℃以下保存，保存期1 個(gè)月。準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，加入空白樣品提取液，配成系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，4℃避光保存，保存期1 周。

1.4 試驗(yàn)條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，50 mm×2.1 mm）；流動(dòng)相：A 為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-水溶液，B 為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-乙腈溶液；流速：0.30 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradient elution

1.4.2 質(zhì)譜條件 電離方式：電噴霧電離ESI+；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；氣簾氣：276 kPa；碰撞氣：中等；離子源溫度：500 ℃；Gas1 壓力：276 kPa；Gas2 壓力：414 kPa；離子噴霧電壓：5 000 V。其它參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Optimized ESI MRM-MS instrument parameters

（續(xù)表2）

1.5 樣品處理

準(zhǔn)確稱?。?±0.05）g 已絞碎混勻的水產(chǎn)肌肉組織于50 mL 具塞離心管中，加入20 mL 1%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸-乙腈溶液，并加入1 g 無水醋酸鈉和1 g 無水硫酸鎂，渦旋混勻2 min，水平振蕩提取10 min，5 000 r/min 離心5 min。

將上清液移入含800 mg PS-DVB 和200 mg PSA 填料的50 mL 具塞離心管中，旋渦混合2 min，取10 mL 上清液于15 mL 離心管中，40 ℃水浴氮吹濃縮至近干。殘留物用1.0 mL 流動(dòng)相溶解，渦旋混合1 min 后，過0.22 μm 微孔濾膜，供LC-MS/MS 上機(jī)檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化的色譜條件

研究了水、甲酸分別和乙腈、甲醇組合的流動(dòng)相體系對目標(biāo)物的峰形及信號強(qiáng)度的影響，結(jié)果表明，用體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸-乙腈溶液為流動(dòng)相時(shí)，大部分目標(biāo)組分有較好的響應(yīng)且峰形尖銳對稱。其原因是：流動(dòng)相中加入適量的甲酸，不僅促進(jìn)目標(biāo)物的電離，提高離子化效率和靈敏度，還抑制目標(biāo)物與液相色譜柱固定相中硅羥基之間的作用，改善峰形，提高分離度。多殘留分析中流動(dòng)相基本為梯度洗脫，為保證梯度變化過程中酸的濃度和離子化氛圍穩(wěn)定，采用體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液作為流動(dòng)相。采用LCMS/MS 分析13 種農(nóng)藥，MRM 譜圖見圖1。

2.2 提取溶劑

農(nóng)藥常用的提取溶劑為甲醇、丙酮和乙腈等溶劑，部分化合物需要加酸調(diào)節(jié)提取溶劑的pH值。為了保證提取效率，根據(jù)目標(biāo)組分的化學(xué)性質(zhì)，分別采用甲醇、乙腈、1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸-甲醇溶液、1%（體積分?jǐn)?shù)） 乙酸-甲醇溶液、1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸-乙腈溶液和1%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸-乙腈溶液為提取溶劑，得到使用不同溶劑時(shí)13 種目標(biāo)組分在加標(biāo)蝦肉中的回收率。采用甲醇為提取溶劑時(shí)，提取效率在30%～70%之間，可能是由于甲醇極性較強(qiáng)，鹽析效果不佳。采用乙腈為提取溶劑時(shí)，目標(biāo)組分有較好的溶解性，無機(jī)鹽的加入使乙腈與水相分層，提高提取效率。同時(shí)，乙腈具有沉淀蛋白的作用，可大大減小雜質(zhì)的影響。甲酸的酸性比乙酸強(qiáng)，部分農(nóng)藥在使用1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸-乙腈溶液提取時(shí)回收率較低，而1%（體積分?jǐn)?shù)） 乙酸-乙腈溶液在13 種目標(biāo)組分的平均回收率在70%～120%之間。最終選擇1%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸-乙腈溶液作為13 種農(nóng)藥的提取溶劑。

圖1 13 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM 譜圖Fig.1 MRM chromatograms of the 13 pesticide standards

2.3 凈化過程的優(yōu)化

水產(chǎn)樣品含有大量的蛋白、脂肪和色素，這些雜質(zhì)在提取過程中隨目標(biāo)物一起被提取出來，產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，影響檢測結(jié)果。QuEChERS 方法中常用的吸附凈化劑有PSA、C18及GCB。PSA 用于去除脂類和糖類物質(zhì)，C18可去除油脂及弱極性雜質(zhì)，GCB 可去除色素。PS-DVB 在QuEChERS 方法中的應(yīng)用報(bào)道較少。其具有高容量、穩(wěn)定的機(jī)械強(qiáng)度，與C18對比具有更強(qiáng)的吸附性能，且PSDVB 價(jià)格低廉，僅為傳統(tǒng)吸附劑的1/5～1/3。

試驗(yàn)對比PSA、C18及PS-DVB 作為吸附凈化劑的凈化效果?？疾爝@3 種吸附凈化劑對13 種目標(biāo)組分的吸附情況，在相同濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入100 mg 的3 種吸附劑，旋渦混合1 min，過0.22 μm 微孔濾膜后測定。結(jié)果表明：C18對部分農(nóng)藥的吸附作用較強(qiáng)，回收率小于40%；而PSA 與PS-DVB 對大多數(shù)目標(biāo)組分吸附較少，可作為凈化劑進(jìn)一步優(yōu)化。本試驗(yàn)嘗試將PS-DVB 與PSA 作為混合吸附凈化劑，發(fā)現(xiàn)PSDVB 的加入可以改善對蝦樣品中的基質(zhì)效應(yīng)。以ME=Slopi/Slop0 評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，ME 為基質(zhì)效應(yīng)，Slopi 為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，Slope0 為純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率[16]。由表3可知，加入PS-DVB后，氯嘧磺隆、異丙草胺、咪酰胺、烯酰嗎啉、三唑酮、噻嗪酮、多菌靈、噻菌靈和抑霉唑等9 種化合物的基質(zhì)減弱效應(yīng)得到改善。同時(shí)考察了PSDVB 用量（200，400，800 mg 和1 000 mg）對目標(biāo)物回收率的影響，結(jié)果表明，采用200 mg PSA 與800 mg PS-DVB 為凈化劑組合時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)較小，回收率最佳。

2.4 方法的線性范圍、定量限、準(zhǔn)確度和精密度

配制13 種農(nóng)藥的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度為1，5，20，50 和100 μg/L，進(jìn)樣10 μL。以各農(nóng)藥的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，定量離子的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并做線性回歸分析，結(jié)果顯示：13 種農(nóng)藥在1～100 μg/L 范圍有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)＞0.99。

在空白樣品中添加13 種農(nóng)藥，信噪比（S/N）為3 時(shí)計(jì)算最低檢出限（LOD）；S/N 為10 時(shí)計(jì)算最低定量限 （LOQ），13 種待測組分的LOD 在0.15～0.75 μg/kg，LOQ 在0.50～2.50 μg/kg，見表3。

用不含13 種農(nóng)藥的羅非魚與對蝦樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)，樣品前處理過程同1.5節(jié)的步驟。在樣品中分別添加5，20 μg/kg 和50 μg/kg 3 個(gè)含量水平，每個(gè)水平做5 次重復(fù)試驗(yàn)，13 種農(nóng)藥的回收率在75%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為6.8%～15.0%，準(zhǔn)確率和精密度均符合殘留檢測的要求。

表3 13 種化合物在對蝦基質(zhì)中的方法確證數(shù)據(jù)（n=5）Table 3 Methodology validation of 13 pesticides in shrimp（n=5）

2.5 實(shí)際樣品測定及風(fēng)險(xiǎn)評估

采用本方法對市售的30 份水產(chǎn)品 （4 份羅非、2 份草魚、2 份鯽魚、2 份生魚、2 份鯪魚和18份對蝦）進(jìn)行測定，結(jié)果在其中的2 份蝦肉中檢出嘧菌酯，含量分別為58.4 μg/kg 和38.6 μg/kg。

嘧菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，最初用于谷物，現(xiàn)廣泛用于農(nóng)作物，具有預(yù)防和治療作用。中國、美國與歐盟僅對多種農(nóng)作物中的嘧菌酯進(jìn)行限量要求，而日本肯定列表中規(guī)定魚肉中的殘留限量為0.08 mg/kg，未對蝦進(jìn)行規(guī)定。嘧菌酯的日允許攝入量（ADI）值為0.2 mg/kg bw，根據(jù)消費(fèi)預(yù)測，2015年城鎮(zhèn)居民人均年水產(chǎn)品消費(fèi)量為19.34 kg[15]，人均日消費(fèi)量為53 g。假定60 kg 的成年人食用上述陽性對蝦，嘧菌酯的日攝入量=人均日消費(fèi)量 殘留量/體重=0.052 μg/kg bw，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于ADI 值。

3 結(jié)論

本研究建立了水產(chǎn)品中13 種農(nóng)藥殘留的改良QuEChERS/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 （LC-MS/MS）檢測方法，方法回收率為75%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%。本方法簡單、靈敏、快速且價(jià)格低廉，適用于水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的定性、定量分析。