馬 媛，張大鵬，王 想，任 蕾

1)駐馬店市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科 河南駐馬店 463000 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 450052

糖尿病腎病是糖尿病重要的并發(fā)癥之一，表現(xiàn)為腎功能衰退、高血壓、蛋白尿等，糖尿病腎病也是終末期腎病發(fā)生的主要原因[1]。大鼠足細(xì)胞凋亡是糖尿病腎病發(fā)生的重要病理變化[2]。?；撬嵴{(diào)節(jié)基因1(taurine up-regulated gene 1，TUG1)是一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)，在人體正常細(xì)胞功能維持以及疾病發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，TUG1不僅參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，還參與動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生過程。前期研究[5]表明，TUG1與糖尿病腎病足細(xì)胞的能量代謝有關(guān)，TUG1在糖尿病腎病發(fā)生過程中表達(dá)下調(diào)。該研究用小鼠足細(xì)胞MPC5體外構(gòu)建糖尿病腎病足細(xì)胞損傷模型，觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白表達(dá)的變化，探討TUG1在高糖條件下足細(xì)胞凋亡中的作用，為明確TUG1在糖尿病腎病損傷中的作用提供參考，為基因治療糖尿病腎病提供思路。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑小鼠足細(xì)胞MPC5購自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)條件為飽和濕度、37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa公司；裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Cleaved-Caspase-12)、裂解的多聚ADP核糖聚合酶(Cleaved-PARP)抗體購自美國(guó)Santa Cruz 公司；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白C/EBP同源蛋白(CHOP)、磷酸化真核細(xì)胞翻譯起始因子2α(p-eIF2α)、78 000葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP78)抗體購自美國(guó)Abcam公司；TUG1過表達(dá)CMV-EGFP慢病毒和陰性對(duì)照PMT406空載體慢病毒均由北京合生基因科技有限公司構(gòu)建。

1.2細(xì)胞分組及處理足細(xì)胞分別用含5.5和25.0 mmol/L葡萄糖的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為對(duì)照組(A組)和高糖組(B組)。MPC5細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后接種到24孔板，每孔105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞融合度為50%左右時(shí)添加慢病毒液(MOI=15)，同時(shí)加入5 mg/L聚凝胺，感染12 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后以含1 mg/L聚凝胺的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)7 d，篩選穩(wěn)定感染的細(xì)胞。感染TUG1過表達(dá)慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒的MPC5細(xì)胞以含25.0 mmol/L葡萄糖的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為陰性對(duì)照高糖組(C組)和TUG1過表達(dá)高糖組(D組)。每組3個(gè)復(fù)孔。

1.3qRT-PCR檢測(cè)各組MPC5細(xì)胞中TUG1的表達(dá)4組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，采用qRT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中TUG1的表達(dá)。PCR引物由南京金斯瑞生物科技公司合成，序列如下：β-actin 上游引物5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物5’-TG TAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’；TUG1上游引物5’-TAACAGCCCTCCACTCCAGAT-3’， 下游引物5’-AGGCACCAGCTTCAAAACCC-3’。以Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，然后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，體系為4 μL 4×Prime Script Buffer、2 μL總RNA、1 μL Oligod T 引物、1 μL反轉(zhuǎn)錄酶混合液Ⅰ、1 μL隨機(jī)六核苷酸引物，添加無RNA酶水至20 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 s。PCR反應(yīng)體系：上下游引物各1 μL、2 μL cDNA、1.6 μL DyeROX、10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqⅡ，添加 ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃孵育30 s，95 ℃孵育10 s，60 ℃孵育30 s，共40個(gè)循環(huán)。按照2-ΔΔCt法計(jì)算TUG1相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)4組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，添加2.5 g/L的胰蛋白酶將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸浮液，PBS洗滌后將細(xì)胞懸浮在250 μL的結(jié)合緩沖液中，然后在細(xì)胞中添加5 μL的PI以及5 μL的Annexin V-FITC溶液，室溫下孵育15 min，添加300 μL的結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Western blot法測(cè)定細(xì)胞中Cleaved-Caspase-12、Cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白的表達(dá)4組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，添加蛋白提取試劑，冰上裂解20 min，高速離心后吸取上清，用BCA方法進(jìn)行定量。將蛋白樣品同Loading Buffer混勻煮沸變性后添加到樣品孔內(nèi)，每孔30 μg，先80 V恒壓電泳約30 min，然后以120 V的電壓電泳2 h。將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后將PVDF膜放在封閉液中，室溫孵育1 h。取出PVDF膜，置于一抗稀釋液(Cleaved-Caspase-12、Cleaved-PARP稀釋度為1∶800，CHOP、p-eIF2α、GRP78稀釋度為1∶1 000)中，4 ℃過夜。PVDF膜與HRP標(biāo)記的二抗在室溫中孵育2 h后，ECL顯色發(fā)光，定影，用Quantity One軟件測(cè)定蛋白條帶的灰度值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)。不同組間TUG1表達(dá)、Cleaved-Caspase-12、Cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白相對(duì)表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞TUG1表達(dá)、凋亡率和Cleaved-Caspase-12、Cleaved-PARP蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較結(jié)果見圖1和表1。與A組相比，B、C、D組細(xì)胞凋亡率升高，Cleaved-Caspase-12、Cleaved-PARP蛋白相對(duì)表達(dá)量升高；與B、C組相比，D組細(xì)胞凋亡率降低，Cleaved-Caspase-12、Cleaved-PARP蛋白相對(duì)表達(dá)量降低。

1：A組；2：B組；3：C組；4：D組

組別TUG1凋亡率/%Cleaved-Caspase-12Cleaved-PARPA組1.00±0.118.32±0.470.18±0.020.35±0.04B組0.56±0.07?26.91±3.24?0.47±0.06?0.74±0.09?C組0.58±0.07?25.89±2.28?0.48±0.08?0.73±0.06?D組1.63±0.18?#16.71±1.36?#0.32±0.03?#0.46±0.04?#F55.51951.44721.40730.873P<0.001<0.001<0.001<0.001

*：與A組比較，P<0.05；#：與B、C組比較，P<0.05

2.2 4組細(xì)胞中CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較結(jié)果見圖2和表2。與A組相比，B、C、D組細(xì)胞中CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白相對(duì)表達(dá)量升高；與B、C組相比，D組細(xì)胞中CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白相對(duì)表達(dá)量降低。

1：A組；2：B組；3：C組；4：D組

組別CHOPp-eIF2αGRP78A組0.33±0.050.23±0.040.57±0.06B組0.68±0.06?0.60±0.08?0.98±0.09?C組0.70±0.07?0.59±0.09?0.99±0.12?D組0.49±0.06?#0.36±0.05?#0.68±0.07?#F25.04121.18317.510P<0.001<0.001<0.001

*：與A組比較，P<0.05；#：與B、C組比較，P<0.05

3 討論

糖尿病腎病作為終末期腎病發(fā)生的首位病因，其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，腎小球基底膜增厚是常見的病理變化[6]。足細(xì)胞功能異常是糖尿病腎病發(fā)生的機(jī)制之一，也是腎小球硬化和蛋白尿產(chǎn)生的重要原因[7]。陳恩平等[8]用高糖處理永生化小鼠足細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)Bax表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡率升高，證明高糖可誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖處理后的足細(xì)胞凋亡率增加，Cleaved-Caspase-12、Cleaved-PARP蛋白表達(dá)水平升高。Caspase-12是Caspase蛋白家族的成員，其只有被激活形成Cleaved-Caspase-12才可以發(fā)揮促凋亡作用[9]。PARP也是細(xì)胞凋亡發(fā)生的促進(jìn)因子，其被活化后形成Cleaved-PARP是細(xì)胞凋亡發(fā)生的標(biāo)志之一[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明高糖可誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生凋亡。

TUG1是一個(gè)在小鼠視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)的lncRNA，定位在22q12.2染色體上，參與血管生成、細(xì)胞耐藥等過程，還與人體腫瘤發(fā)生有關(guān)[11]。Lei等[5]發(fā)現(xiàn)在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠和高糖處理的MPC5細(xì)胞中TUG1水平降低，高糖處理的MPC5細(xì)胞凋亡增加；黃芪甲苷Ⅳ處理可上調(diào)TUG1表達(dá)水平并減少足細(xì)胞凋亡，說明TUG1可能參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。Long等[12]發(fā)現(xiàn)，TUG1參與了糖尿病腎病足細(xì)胞的能量代謝，誘導(dǎo)足細(xì)胞產(chǎn)生ATP。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高糖處理后的足細(xì)胞中TUG1表達(dá)水平降低，與上述研究結(jié)果一致；過表達(dá)TUG1高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡率顯著降低，Cleaved-Caspase-12、Cleaved-PARP表達(dá)水平降低，說明過表達(dá)TUG1可以抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，TUG1在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷中可能發(fā)揮保護(hù)作用。

CHOP、p-eIF2α、GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志蛋白，近些年來，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡發(fā)生的途徑之一，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)GRP78大量表達(dá)，并激活CHOP和Caspase-12，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；PERK與GRP78解離后活化eIF2α，活化的eIF2α誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13-14]。研究[15]顯示高糖處理的足細(xì)胞中GRP78、p-PERK、Caspase-12蛋白表達(dá)水平升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達(dá)水平升高，過表達(dá)TUG1高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達(dá)水平降低，表明TUG1可能通過減弱高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生，這可能是TUG1調(diào)控細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

總之，TUG1在糖尿病腎病進(jìn)展中可能發(fā)揮保護(hù)作用，過表達(dá)TUG1可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而減少高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為明確TUG1在糖尿病腎病發(fā)生中的作用提供了參考，為基因靶向治療糖尿病腎病提供了可能。