郭 丹，閆秀明，楊 亮，石 科

1)河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?？蒲袑?shí)驗(yàn)中心 鄭州 451191 2)河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校檢驗(yàn)系生物化學(xué)教研室 鄭州 451191 3)河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校檢驗(yàn)系微生物與免疫學(xué)教研室 鄭州 451191

HOX基因又名Ⅰ型同源異形盒基因，是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞增殖、分化等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，決定胚胎和器官的發(fā)育[1]。研究[2]表明，HOX基因與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，有可能成為癌癥早期診斷和基因治療的分子靶點(diǎn)。因此探討HOX基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，對(duì)腫瘤的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估具有指導(dǎo)意義[3]。HOX根據(jù)序列的相似性及其在染色體上的位置可以分為HOXA、HOXB、HOXC和HOXD 四個(gè)家族[4]。HOXA6定位于人類染色體7p15.3，全長(zhǎng)2 192 bp。據(jù)報(bào)道[5-6]HOXA6可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。然而HOXA6在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)如何，是否對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖和凋亡有影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒技術(shù)上調(diào)人肺腺癌A549細(xì)胞中HOXA6基因的表達(dá)，觀察細(xì)胞增殖和凋亡的變化，探討HOXA6是否參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與主要試劑293T細(xì)胞、人正常支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞、A549細(xì)胞均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。慢病毒載體系統(tǒng)購自上海吉?jiǎng)P基因公司，QIAamp DNA Mini試劑盒購自德國Qiagen公司，胎牛血清、胰蛋白酶和RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司,Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司，PCR引物由上海生工生物公司合成，CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，凋亡檢測(cè)試劑盒購自凱基生物技術(shù)公司，HOXA6、GAPDH、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax和Bcl-2一抗購自美國Abcam公司，HRP標(biāo)記的二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Nanodrop 100核酸定量分析儀購自美國Thermo公司，流式細(xì)胞儀購自美國Bectone Dickson公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)BEAS-2B和A549細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2～3 d傳代。

1.3BEAS-2B和A549細(xì)胞中HOXA6mRNA的檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行qRT-PCR。HOXA6引物：上游5’-TACACGCGCTACCAGACAC-3’，下游5’-GCGT GGAATTGATGAGCTTGTTT- 3’；GAPDH引物：上游5’-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3’，下游5’- AGGGGTCATTGATGGCAACA-3’。反應(yīng)體系：上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，10×擴(kuò)增緩沖液 2 μL，dNTP 2 μL，模板DNA 0.2 μg，Taq DNA聚合酶0.2 μL，1.5 mmol/L Mg2+1.5 μL,加雙蒸水至20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃10 min，30個(gè)循環(huán)；94 ℃15 s，60 ℃32 s退火延伸。用2-ΔΔCt法計(jì)算HOXA6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4BEAS-2B和A549細(xì)胞中HOXA6蛋白的檢測(cè)用RIPA提取細(xì)胞中總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取20 μg蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉4 ℃過夜封閉，加一抗(HOXA6按1∶3 000稀釋，GAPDH按1∶4 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，二抗(按1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影，掃描條帶，并用Image J分析。先以BEAS-2B或A549細(xì)胞中HOXA6蛋白與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為HOXA6蛋白的表達(dá)水平，再以A549與BEAS-2B細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平的比值作為A549細(xì)胞的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5HOXA6過表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

1.5.1 細(xì)胞分組 將A549細(xì)胞分為正常對(duì)照組(未處理)、陰性對(duì)照組(感染陰性對(duì)照慢病毒)和HOXA6過表達(dá)組(感染HOXA6過表達(dá)慢病毒)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.5.2 3組細(xì)胞中HOXA6 mRNA和蛋白的表達(dá) 采用qRT-PCR和Western blot法檢測(cè)，方法同1.3和1.4。

1.5.3 3組細(xì)胞存活率檢測(cè) 將細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL CCK-8試劑，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸棄上清，每孔加入150 μL的DMSO室溫振蕩10 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A/正常對(duì)照組A×100%。

1.5.4 3組細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用Annexin V-APC/7-AAD凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。接種細(xì)胞至6孔板，4 ℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，用 250 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。取 100 μL細(xì)胞懸液于 5 μL流式管中，加入 Annexin V-APC和 7-AAD 溶液各1 μL ，混勻后室溫避光孵育 10 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.5 3組細(xì)胞中cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，參照1.4用Western blot法檢測(cè)cleaved Caspase-3(一抗按1∶3 000稀釋)、cleaved Caspase-9(一抗按1∶3 000稀釋)、Bax(一抗按1∶2 500稀釋)、Bcl-2(一抗按1∶3 000稀釋)蛋白的表達(dá)情況。先以目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值作為目的蛋白的表達(dá)水平，再以實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組目的蛋白表達(dá)水平的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0分析，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較A549和BEAS-2B細(xì)胞中HOXA6 mRNA和蛋白的表達(dá)。采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)比較3組細(xì)胞增殖、凋亡情況。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較陰性對(duì)照組和HOXA6過表達(dá)組HOXA6 的表達(dá)、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)和Bax/Bcl-2的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞中HOXA6表達(dá)的比較BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞中HOXA6 mRNA的表達(dá)水平分別為(1.00±0.17)和(0.57±0.03)，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.314,P=0.013)。A549細(xì)胞中HOXA6 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平為(0.58±0.02)，低于BEAS-2B細(xì)胞。

2.2A549細(xì)胞中HOXA6表達(dá)的比較結(jié)果見圖1和表1。

1：正常對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：HOXA6過表達(dá)組

組別nmRNA蛋白陰性對(duì)照組30.98±0.030.96±0.07HOXA6過表達(dá)組31.65±0.131.55±0.15t8.6716.310P0.0010.003

2.3A549細(xì)胞存活率和凋亡率的比較HOXA6過表達(dá)組A549細(xì)胞存活率降低，凋亡率增加(表2)。

表2 3組A549細(xì)胞存活率和凋亡率的比較%

*：與其他兩組相比，P<0.05

2.4A549細(xì)胞中cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)和Bax/Bcl-2比值的比較結(jié)果見圖2和表3。

1：正常對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：HOXA6過表達(dá)組

組別ncleaved Caspase-3蛋白cleaved Caspase-9蛋白Bax/Bcl-2陰性對(duì)照組30.97±0.071.05±0.121.02±0.17HOXA6過表達(dá)組32.57±0.473.11±0.352.95±0.18t5.9139.81113.780P0.004<0.001<0.001

3 討論

有研究[7]表明，HOX基因在大多數(shù)實(shí)體瘤中被上調(diào)或下調(diào)，而且特定的HOX基因在癌癥中的表達(dá)往往會(huì)根據(jù)組織類型和腫瘤部位而有所不同。HOX基因在多種腫瘤中表達(dá)異常，其表達(dá)調(diào)控涉及染色體表觀修飾以及一些信號(hào)分子[8-9]。Kishida等[10]報(bào)道成人慢性淋巴瘤和兒童急性淋巴瘤中HOXA6基因出現(xiàn)高甲基化，導(dǎo)致HOXA6蛋白表達(dá)下調(diào)和功能異常，被鑒定為抑癌基因。有研究[11-13]表明HOXA家族基因在肺癌組織中的表達(dá)低于正常肺組織。本研究結(jié)果顯示，與正常支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞相比，肺癌A549細(xì)胞中HOXA6 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均下降，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

Wu等[5]認(rèn)為HOXA6過表達(dá)抑制了結(jié)直腸癌Caco2和HT-29細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力，并誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，而用siRNA抑制HOXA6的表達(dá)后表現(xiàn)出相反的作用，可能與HOXA6通過Bcl-2信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡有關(guān)。研究[14]顯示腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞中HOXA6過表達(dá)后，細(xì)胞存活減少，凋亡增加；而抑制HOXA6表達(dá)的腎透明細(xì)胞細(xì)胞增殖增加，凋亡降低。本文的研究結(jié)果表明，A549細(xì)胞HOXA6過表達(dá)后細(xì)胞存活能力降低，凋亡增加，促細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的降解產(chǎn)物cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9的表達(dá)亦顯著增高，凋亡相關(guān)因子Bax/Bcl-2比值增加，提示HOXA6過表達(dá)誘導(dǎo)了A549細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能與Bcl-2信號(hào)通路有關(guān)。

總之，HOXA6過表達(dá)可抑制A549細(xì)胞的增殖，可能通過Bcl-2相關(guān)信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。