肖正紅，謝廣倫，翟煥閣，王蘇芳

1)南陽南石醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 河南南陽 473065 2)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院疼痛科 鄭州450008

腎癌是一種發(fā)展速度快、早期臨床癥狀不明顯的常見惡性腫瘤，其發(fā)病機制較為復(fù)雜，多種基因在腎癌發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1]?；虬邢蛑委熞呀?jīng)成為腎癌治療的有效途徑[2]。不同于正常細胞，有氧糖酵解是腫瘤細胞特有的能量供應(yīng)方式，無論是有氧還是乏氧條件下腫瘤細胞均以糖酵解為主要代謝途徑，研究腫瘤細胞糖酵解機制對于闡明腫瘤發(fā)病機制具有重要意義[3]。Twist是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用[4]。目前的研究[5-7]顯示，Twist是一種癌基因，在多種腫瘤組織如腎癌、胃癌、宮頸癌等組織中高表達，敲低其表達可以抑制多種腫瘤細胞的生長。已經(jīng)證實Twist具有促進乳腺癌細胞能量代謝的作用[3]。己糖激酶2(HK2)和丙酮酸激酶M2亞型(PKM2)是糖酵解途徑中的關(guān)鍵限速酶。本實驗利用shRNA技術(shù)下調(diào)腎癌細胞A498中Twist的表達，觀察細胞增殖活性，細胞中糖酵解關(guān)鍵酶PKM2、HK2表達水平及糖酵解代謝水平的變化，為闡明腎癌分子發(fā)病機制及靶向Twist治療提供參考。

1 材料與方法

1.1細胞來源及主要試劑、儀器A498購自美國ATCC，細胞用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中添加青、鏈霉素。ATP含量檢測試劑盒、乳酸含量檢測試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司，葡萄糖含量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Twist shRNA(序列為GCGCTAGAATGTACTCGTTAC)和陰性對照(shRNA-NC)由北京百奧川生物科技有限責(zé)任公司合成,將shRNA序列載入pGPU6-GFP-Neo表達載體, 構(gòu)建pGPU6-Twist-GFP-Neo慢病毒和陰性對照慢病毒；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自大連TaKaRa公司； Twist抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology，HK2、PKM2抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(山羊抗兔IgG)購自上海容創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；MTT檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2實驗分組將A498細胞分成3組：Twist shRNA、shRNA-NC、空白對照組。Twist shRNA、shRNA-NC組細胞分別穩(wěn)定感染Twist shRNA慢病毒和shRNA-NC慢病毒，空白對照組不做慢病毒感染。A498培養(yǎng)至細胞密度約為30%時，添加病毒液(MOI=20)，繼續(xù)孵育10 h后，吸棄上清，添加細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d后，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光水平。用嘌呤霉素篩選細胞，檢測細胞中Twist mRNA 和蛋白的表達，以評估沉默效果。

1.3細胞中Twist mRNA 和蛋白表達的檢測①qRT-PCR：Trizol法提取細胞總RNA，操作同試劑說明書。取0.5 μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃10 min。PCR引物：Twist 正義鏈 5’-GTGGACAGTGATTCCCAGACGG-3’，反義鏈 5’-CAGTGGCTGATTGGCACGACCT-3’；GAPDH正義鏈 5’-CATCAAGAAGGTGGTGAAG CAGG-3’，反義鏈 5’-AAAGGTGGAGGAGTGGGT GTCG-3’。引物均由上海英駿公司合成。PCR反應(yīng)條件為95 ℃10 s；95 ℃10 s，58 ℃30 s，共循環(huán)40次。以未加細胞的培養(yǎng)液為對照。Twist mRNA相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。②Western blot：提取細胞總蛋白，經(jīng)BCA法檢測濃度后，行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜，于50 g/L牛血清白蛋白封閉液中室溫放置1.5 h。再將NC膜置于含有一抗(Twist抗體以1∶400稀釋，GAPDH抗體以1∶1 000稀釋)的平皿內(nèi)，4 ℃過夜，再于二抗(以1∶3 000稀釋)孵育液中室溫反應(yīng)2 h，ECL發(fā)光。利用Quantity One軟件統(tǒng)計條帶灰度值，以Twist與GAPDH條帶灰度值的比值表示Twist蛋白表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.4MTT法檢測細胞增殖分別取3組細胞接種到96孔板內(nèi)，每孔104個，培養(yǎng)48 h后，每孔中加入20 μL的MTT溶液孵育4 h，去上清，添加150 μL的DMSO，10 min后用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的光密度。細胞存活率=實驗組光密度值/培養(yǎng)液對照光密度值×100%。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.5平板克隆實驗檢測細胞克隆形成能力分別取3組細胞，配制成2 000個/mL的懸液，吸取100 μL到60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，加5 mL細胞培養(yǎng)液培養(yǎng),每2 d換液1次。14 d后，用PBS洗滌細胞2次，甲醇固定，吉姆薩染色，于顯微鏡下觀察，計數(shù)>50個細胞的集落?？寺⌒纬陕?(集落數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。

1.6Western blot法檢測細胞中HK2和PKM2蛋白的表達細胞分組培養(yǎng)48 h后，用Western blot法檢測細胞中HK2和PKM2蛋白表達水平，操作同1.3，HK2和PKM2一抗以1∶400稀釋。

1.7乳酸分泌水平、ATP含量和葡萄糖消耗量的檢測分組培養(yǎng)48 h后，分別收集3組細胞的培養(yǎng)上清，3 500 r/min離心5 min，收集上清。用乳酸脫氫酶比色法檢測上清中乳酸含量;用葡萄糖氧化酶法檢測上清中葡萄糖含量，并以培養(yǎng)液對照中的葡萄糖含量與各實驗組上清中葡萄糖含量的差值表示葡萄糖消耗量；用比色法檢測ATP含量。具體操作均按照試劑盒說明進行。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)用SPSS21.0分析，3組Twist mRNA，Twist、PKM2、HK2蛋白表達水平，細胞存活率，克隆形成率，ATP含量，乳酸分泌水平及葡萄糖消耗量的比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組細胞中Twist表達水平的比較Western blot結(jié)果見圖1、表1。Twist shRNA組細胞Twist mRNA和蛋白表達水平均低于空白對照組和shRNA-NC組。

1、2、3：分別為空白對照組、shRNA-NC組、Twist shRNA組

組別nTwist mRNATwist 蛋白空白對照組31.00±0.110.45±0.06shRNA-NC組31.01±0.120.43±0.07Twist shRNA組30.36±0.04?0.14±0.03?F44.42428.819P<0.0010.001

*：與空白對照組和shRNA-NC組比較，P<0.05

2.2 3組細胞存活率和克隆形成率的比較見表2。Twist shRNA組細胞存活率和克隆形成率均低于空白對照組和shRNA-NC組。

表2 3組細胞存活率和克隆形成率的比較

*：與空白對照組和shRNA-NC組比較，P<0.05

2.3 3組細胞中PKM2、HK2蛋白表達水平的比較見圖2和表3。Twist shRNA組細胞中PKM2、HK2蛋白表達水平均低于空白對照組和shRNA-NC組。

1、2、3：分別為空白對照組、shRNA-NC組、Twist shRNA組

組別nPKM2HK2空白對照組30.36±0.040.68±0.08shRNA-NC組30.35±0.060.67±0.05Twist shRNA組30.19±0.02?0.14±0.03?F14.62587.643P0.005<0.001

*：與空白對照組和shRNA-NC組比較，P<0.05

2.4 3組細胞培養(yǎng)上清中ATP含量、乳酸分泌水平及葡萄糖消耗量的比較見表4。Twist shRNA組細胞中ATP含量、乳酸分泌水平及葡萄糖消耗量均較空白對照組和shRNA-NC組降低。

表4 3組細胞培養(yǎng)上清中ATP含量、乳酸分泌水平及葡萄糖消耗量的比較μmol/L

組別nATP含量乳酸分泌水平葡萄糖消耗量空白對照組3147.23±11.2512.85±1.145.17±0.65shRNA-NC組3145.02±13.2013.04±1.265.23±0.52Twist shRNA組394.12±10.51?8.15±0.71?3.15±0.20?F19.75520.36317.213P0.0020.0020.003

*：與空白對照組和shRNA-NC組比較，P<0.05

3 討論

Twist屬于螺-環(huán)-螺轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族成員，是一個進化十分保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[8]。Twist在內(nèi)胚層來源的細胞和組織中表達，在成人心臟、骨骼肌、胰腺、腎臟及胎盤等組織中表達，在腦組織中幾乎不表達[9]。隨著研究的進展，人們發(fā)現(xiàn)，Twist在乳腺癌、肝癌、宮頸癌等多種類型的癌組織中表達水平升高[10-12]，參與腫瘤細胞生長的調(diào)控。敲低Twist可以體外抑制宮頸癌、食管癌等腫瘤細胞的生長，并且可以抑制結(jié)腸癌、胃癌等細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力[13-15]。已有研究[16]顯示，Twist表達水平升高與腎癌惡性進展關(guān)系密切。本實驗結(jié)果顯示，下調(diào)Twist表達后，腎癌細胞的存活能力和克隆形成能力均降低，Twist在腎癌中可能發(fā)揮癌基因的作用。

腫瘤細胞在氧氣充足條件下仍然優(yōu)先以有氧糖酵解為主要供能方式，這種現(xiàn)象稱為Warburg效應(yīng)，Warburg效應(yīng)也被認為是腫瘤細胞的重要特征之一[17-18]。PKM2、HK2是糖酵解途徑中的關(guān)鍵限速酶，二者在腫瘤細胞中的表達水平升高，能夠促進糖酵解，為腫瘤細胞的生長提供ATP[19]。Twist作為一種癌基因，不僅與腫瘤細胞的生長有關(guān)，還與腫瘤細胞的糖酵解過程有關(guān)。Twist可以誘導(dǎo)乳腺癌細胞中PKM2的表達，促進乳腺癌細胞的代謝途徑從氧化磷酸化向糖酵解轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)乳腺癌細胞重塑能量代謝途徑[3,20]。乳酸是糖酵解產(chǎn)物之一，其可以被分泌至細胞外，檢測培養(yǎng)上清中乳酸含量可以間接反應(yīng)細胞糖酵解水平[21-22]。本實驗結(jié)果顯示，下調(diào)Twist后腎癌細胞中PKM2、HK2蛋白的表達降低，ATP含量下降，乳酸分泌水平和葡萄糖消耗量下降，說明下調(diào)Twist能夠降低糖酵解關(guān)鍵酶的表達，抑制腎癌細胞有氧糖酵解水平。

總而言之，下調(diào)Twist可能通過抑制腎癌細胞中糖酵解關(guān)鍵酶的表達，減少細胞合成ATP，從而抑制腎癌細胞生長。本實驗結(jié)果為靶向Twist治療腎癌提供了參考依據(jù)。