APOE基因多態(tài)性與腦損傷所致全面性發(fā)育落后的相關(guān)性分析

劉黎禮，楊 琳，馬迎歌，王 瓊，鐵曉玲

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 西安 710003；2.西安交通大學(xué)附屬西安市兒童醫(yī)院，陜西 西安 710002)

全面性發(fā)育落后(global developmental delay，GDD)是一種神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，據(jù)《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(第5版)》(agnosia and statistical manual of mental disorders，DSM-Ⅴ)的最新診斷標(biāo)準(zhǔn)，全面性發(fā)育落后是一組年齡小于5歲，有粗/精細(xì)運(yùn)動、語言、認(rèn)知理解及社交功能等兩個及以上多能區(qū)的發(fā)育落后[1]。全面性發(fā)育落后的病因較為復(fù)雜，國外研究顯示的病因包括宮內(nèi)發(fā)育不良、宮內(nèi)窘迫、早產(chǎn)兒腦損傷、胚胎期的毒物或者藥物所致畸形、環(huán)境剝脫及遺傳性疾病等[2]。而國內(nèi)在這方面研究較少，近些年有報(bào)道顯示在腦損傷的病因中，新生兒缺氧缺血性腦病、窒息、宮內(nèi)窘迫及發(fā)育不良等在全面性發(fā)育落后的危險因素中所占比例最高[3]。我們之前的研究顯示，全面性發(fā)育落后與載脂蛋白E(APOE)等位基因ε4存在相關(guān)性[4]。等位基因ε4通過APOE 4的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)其功能。有研究顯示，神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)損傷時，APOE 4有抑制神經(jīng)修復(fù)、阻滯神經(jīng)軸突外生長等作用，從而加重腦損傷程度，遺留更為嚴(yán)重的功能障礙[5]。本研究對全面性發(fā)育落后患兒從病因角度分為兩組，即多種原因腦損傷遺留全面性發(fā)育落后組(A組)和不明原因所致全面性發(fā)育落后組(B組)，通過對兩組中APOE等位基因ε4及其各基因型在兩組中的頻率分布進(jìn)行分析，了解APOE基因多態(tài)性與腦損傷所致全面性發(fā)育落后患兒的相關(guān)性。

1研究對象與方法

1.1研究對象

選取2015年4月至2019年3月在西安交通大學(xué)附屬西安市兒童醫(yī)院康復(fù)門診及住院部治療的全面性發(fā)育落后患兒共108例。按照病因進(jìn)行分類，其中由明確腦損傷(如宮內(nèi)窘迫、缺氧缺血性腦病、顱內(nèi)出血、早產(chǎn)兒腦損傷、新生兒期腦炎等)所致全面性發(fā)育落后患兒歸納為A組，不明原因所致的全面性發(fā)育落后患兒歸納為B組。A組中男31例，女26例，共57人，年齡4～58月齡；B組中男24例，女27例，共51人，年齡5～58月齡。兩組在性別、年齡等一般資料比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)

按照美國《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(第5版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<5歲，幼兒期其病情嚴(yán)重程度不能準(zhǔn)確評估；②存在2個以上能區(qū)發(fā)育落后；③無法系統(tǒng)性完成智力評估，如年齡過小不能配合者。1月齡～4歲采用蓋澤爾發(fā)育診斷量表，>4～≤6歲采用韋氏幼兒發(fā)育量表中國修訂版。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn)

①腦性癱瘓所致發(fā)育障礙；②自閉癥譜系障礙所致發(fā)育障礙；③3個月內(nèi)進(jìn)行過輸血的發(fā)育落后患兒；④明確遺傳代謝病所導(dǎo)致的發(fā)育障礙。

1.4方法

收集各組患兒空腹晨起靜脈血3～4mL，以四乙酸二氨基乙烷抗凝，提取紅細(xì)胞中DNA，利用PCR擴(kuò)增和HhaⅠ酶切消化，進(jìn)行載脂蛋白基因分型。通過APOE在112和158位上密碼子的多態(tài)性，區(qū)分出三種等位基因(ε2、ε3、ε4)。引物序列如下：

正向引物 GTAAAACGACGGCCAGTGCGGG

CACGGCTGTCCAACCTG。

反向引物 GGAAACAGCTATGACCATGCAC

GCGGCCCTGTTCCTGGAG。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)資料用百分率表示，對數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方及Fisher確切概率法檢測，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組中APOE各基因型頻率的分布

此次檢出基因型五種，分別為ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε4、ε3/ε3、ε4/ε4，ε2/ε2未檢測出。A組中ε2/ε3占9.1%、ε2/ε4占1.8%、ε3/ε4占18.2%、ε3/ε3占65.5%、ε4/ε4占5.4%，B組中ε2/ε3占14.0%、ε2/ε4占2.0%、ε3/ε4占10.0%、ε3/ε3占74.0%、ε4/ε4為0。ε3/ε3頻率在兩組中均最高，但五種基因型在兩組中的分布頻率比較并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=6.92,P>0.227)，見表1。

表1 兩組中APOE基因型的分布[n(%)]

2.2兩組中等位基因頻率的分布

A組中ε2占5.2%、ε3占78.1%、ε4占16.7%，B組中ε2占9.8%、ε3占84.3%、ε4占5.9%，兩組中ε3占比均最高，兩組中三種等位基因ε2、ε3、ε4的分布頻率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=7.17,P<0.05)，見表2。

表2 兩組中APOE等位基因的頻率分布[n(%)]

2.3 APOE等位基因ε4攜帶頻率在兩組中的分布

根據(jù)APOE基因?qū)⑺谢純悍譃棣?攜帶者與非攜帶者，兩組ε4攜帶頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.41,P<0.05)，見表3。

表3 兩組中APOE ε4等位基因攜帶頻率的分布[n(%)]

3討論

3.1 APOE基因與神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)性

APOE基因位于人類第19號染色體，定位在長臂13區(qū)2帶(19q13.2)，APOE一共有三種等位基因，分別為ε2、ε3和ε4，在人群中ε3的表達(dá)率最高，可達(dá)到70%～78%，ε2和ε4則分別為5%～10%和14%～20%。三種等位基因的任意組合形成六種基因型，分別為三種純合子ε2/ε2、ε3/ε3、ε4/ε4和三種雜合子ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε4。六種基因型分別編碼APOE的三種不同的種型：基因型ε2/ε2、ε2/ε3編碼APOE2，基因型ε3/ε3編碼APOE3，基因型ε4/ε4、ε2/ε4、ε3/ε4編碼APOE4。有研究表明，APOE在神經(jīng)系統(tǒng)中是一個極為重要的脂蛋白，并參與脂質(zhì)和膽固醇在神經(jīng)細(xì)胞中的代謝活動。它可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，維持大腦內(nèi)環(huán)境的平衡，在腦細(xì)胞膜的修復(fù)及其樹突外生長方面也有著非常重要的作用，因此，2008年Balin等研究發(fā)現(xiàn)APOE具有保護(hù)和修復(fù)大腦神經(jīng)的能力，APOE基因所編碼的APOE與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有著非常密切的關(guān)系，在認(rèn)知障礙性疾病的發(fā)生及發(fā)展過程中，APOE參與其中。金春霞等[6]研究顯示孕期脂代謝異?？赡芘c不良妊娠結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險升高相關(guān)，2009年楊雯等研究發(fā)現(xiàn)新生兒中存在ε4等位基因者發(fā)生高脂血癥的風(fēng)險增加。近年來，關(guān)于兒童APOE基因多態(tài)性與腦癱和認(rèn)知功能障礙的關(guān)系的報(bào)道也逐漸增多。2010年王立蘋等研究提示腦性癱瘓(痙攣型)與載脂蛋白ε4等位基因具有相關(guān)性。李曉捷等[7]進(jìn)一步研究還提示，攜帶載脂蛋白等位基因ε4頻率的增高可能是腦性癱瘓合并智力低下患兒的一種遺傳易感因素。據(jù)本人近期對APOE基因多態(tài)性與全面性發(fā)育落后患兒相關(guān)性研究提示[4]，在全面性發(fā)育落后患兒中，APOE等位基因ε4的攜帶頻率明顯高于正常兒童組。2009年Michelle的動物實(shí)驗(yàn)顯示：在攜帶ε4的轉(zhuǎn)基因小鼠中，在經(jīng)歷缺氧性腦損傷后，CA1椎體細(xì)胞層在大腦中的損傷較未攜帶ε4的小鼠更為嚴(yán)重。國外研究顯示，APOE在正常的腦細(xì)胞中并不表達(dá)，只有顱腦受損時，載脂蛋白基因則開始轉(zhuǎn)錄表達(dá)不同的載脂蛋白，例如缺血缺氧性損傷發(fā)生時。而不同的載脂蛋白其作用也不甚相同[8]。APOE3與APOE2對受損神經(jīng)元具有營養(yǎng)修復(fù)的作用，它們可以提高β淀粉樣蛋白的降解速度，降解產(chǎn)物與Tau蛋白結(jié)合，抑制Tau磷酸化，減少神經(jīng)纖維的纏結(jié)，達(dá)到修復(fù)和保護(hù)受損顱神經(jīng)的作用；而APOE4與APOE3、APOE2的作用正好相反，它通過升高血漿中的膽固醇的濃度，惡化動脈粥樣硬化，從而導(dǎo)致大腦中動脈的增厚和神經(jīng)纖維纏結(jié)的加重，進(jìn)一步加重腦神經(jīng)受損[9-11]。2008年HE等的研究顯示，攜帶不同載脂蛋白亞型的正常人，正常情況下在腦電活動方面并無差異，而只有當(dāng)腦組織受到創(chuàng)傷的情況下，APOE才會影響大腦的放電活動，這種影響體現(xiàn)在腦電背景慢波增多，波幅抑制等方面。2010年印曉鴻等的研究發(fā)現(xiàn)等位基因ε3和等位基因ε2的攜帶者其腦電背景出現(xiàn)慢活動較少，而載脂蛋白ε4攜帶者存在背景慢波的明顯增多。2007年顧奕等的研究顯示腦部在受到嚴(yán)重?fù)p傷時，攜帶ε4的人群更易出現(xiàn)嚴(yán)重的腦損傷，遺留較為嚴(yán)重的后遺癥狀。

3.2 APOE ε4與腦損傷所致全面性發(fā)育落后的相關(guān)性

此次研究選擇腦損傷所致全面性發(fā)育落后患兒57名和不明原因所致全面性發(fā)育落后患兒51名，進(jìn)行APOE基因各亞型的檢測，共檢測出5種基因型，分別為ε3/ε3、ε4/ε4、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε4，而ε2/ε2在本次實(shí)驗(yàn)中未檢測出，考慮這可能與自然界中基因型ε2/ε2出現(xiàn)頻率少有關(guān)。本研究中的A組和B組，基因型ε3/ε3出現(xiàn)的頻率最高，基因型ε4/ε4、ε2/ε2則出現(xiàn)較少，而五種基因型在兩組中的分布頻率比較并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。兩組中三種等位基因的分布顯示，等位基因ε3的占比在兩組中均為最高，ε2、ε4較低，且三種等位基因ε2、ε3、ε4的頻率分布比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與既往1996年Srinivasan等的研究相符。而ε4在腦損傷所致全面性發(fā)育落后的A組攜帶頻率明顯高于B組，提示ε4與腦損傷所致全面性發(fā)育落后可能具有一定相關(guān)性。據(jù)1995年Nicoll研究提示，腦部損傷的急性期，攜帶APOE等位基因ε4的患者其腦組織中出現(xiàn)β淀粉樣蛋白的蓄積，它與APOE4結(jié)合也導(dǎo)致β淀粉樣蛋白清除減慢。2007年顧奕等研究發(fā)現(xiàn)攜帶APOE等位基因ε4的患者在出現(xiàn)腦損傷時，APOE4通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)吞噬作用，使得細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被干擾，Ca2+的穩(wěn)定性遭到破壞，內(nèi)流進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，最終進(jìn)一步加重了腦部損傷的程度。

3.3 本研究的不足

本研究顯示，攜帶ε4等位基因出現(xiàn)頻率的增高可能與腦損傷所致全面性發(fā)育落后存在一定的相關(guān)性，而腦損傷的幼兒如攜帶ε4等位基因更可能是全面發(fā)育落后的一種易感因素，在后期的研究中我們將進(jìn)一步完成APOE的定量分析，并對全面發(fā)育落后的患兒進(jìn)行后期隨訪，希望能夠深入對全面發(fā)育落后病因的認(rèn)識，做到早識別、早干預(yù)，改善其預(yù)后。