不同滅菌方式對螺旋藻及其發(fā)酵后營養(yǎng)功效成分的影響

劉云鵬　尤升波　馬德源　尤常清　烏日娜　武俊瑞　黃超　于金慧　畢玉平

摘要：為明確不同滅菌方式對螺旋藻功效成分的影響，本研究采用高溫蒸汽滅菌、超高壓滅菌和紫外線滅菌三種方式對螺旋藻培養(yǎng)基進行滅菌處理，并結(jié)合乳酸菌發(fā)酵方法，比較分析不同滅菌方式處理下發(fā)酵前后上清液與固形物中總黃酮、總酚、藻藍素等成分含量，并對其抗氧化活性進行測定。結(jié)果表明，發(fā)酵前，不同滅菌方式下各成分含量差異較大，部分達顯著水平，其中，以高溫蒸汽滅菌的上清液總黃酮和總酚含量最高，藻藍素含量最低;固形物醇提液中總黃酮含量則以超高壓滅菌最高，總酚和藻藍素含量以紫外線滅菌的最高。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，總黃酮和藻藍素含量整體呈下降趨勢，最大降幅分別為60.0%、74.9%，總酚的變化與之相反，增幅最高為142.4%。從抗氧化活性來看，三種滅菌方式之間抗氧化活性具有一定差異;乳酸菌發(fā)酵提高了高溫滅菌的上清液中總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力，高壓滅菌的還原力和亞鐵離子螯合能力;而發(fā)酵后固形物醇提液的總抗氧化能力、還原力和亞鐵離子螯合能力均顯著升高，DPPH自由基清除能力略有下降。綜合各因素，高溫蒸汽滅菌可用于開發(fā)螺旋藻益生菌產(chǎn)品。

關鍵詞：螺旋藻;高溫蒸汽滅菌;超高壓滅菌;紫外線滅菌;功效成分;抗氧化活性

中圖分類號：S555+.609.9文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）10-0065-06

Effects of Different Sterilization Methods on

Functional Components of Spirulina and after Fermentation

Liu Yunpeng1，2， You Shengbo1， Ma Deyuan1， You Changqing3，

Wu Rina4， Wu Junrui4， Huang Chao1， Yu Jinhui1， Bi Yuping1

（1. Biotechnology Research Center， Shangdong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China;

2. College of Life Sciences， Shandong Normal University， Jinan 250014， China;

3. College of Life Sciences， Shihezi University， Shihezi 832003， China;

4. College of Food Science， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China）

Abstract In order to determine the effect of different sterilization methods on the effective components of Spirulina， the high-temperature steam sterilization， ultrahigh-pressure sterilization and ultraciolet sterilization were adopted and compared. The contents of total flavonoids， total phenols， and phycocyanin in the supernatant and solid matter of Spirulina before and after fermentation were analyzed under sterilization， as well as the antioxidant activity. The results showed that there were significant differences in the content and antioxidant activity of each component under different sterilization methods before fermentation. Among them， the content of total flavonoids and total phenols in supernatant was the highest when sterilized by high-temperature steam， while the content of phycocyanin was the lowest; the content of total flavonoids in alcohol extract of solid matter was the highest under ultrahigh-pressure sterilization， while the content of phycocyanin and total phenols were the highest under ultraviolet sterilization. After fermentation with lactic acid bacteria， the content of total flavonoids and phycocyanin showed an overall downward trend with the largest decrease of 60.0% and 74.9% respectively. In contrast， the total phenols increased with the highest increase of 142.4%. From the perspective of antioxidant activity， there were some differences in the three sterilization methods. After fermentation， in the supernatant， the total antioxidant capacity and DPPH scavening ability under high-temperature sterilization and the reducing power and chelating ability of ferrous ion under high-pressure sterilization were enhanced; and the total antioxidant capacity， reducing ability and chelating ability of ferrous ion in the alcohol extract of solid matter increased significantly， while the DPPH scavening ability decreased slightly. Considering all the factors， high-temperature steam sterilization could be used to develop probiotics products of Spirulina.

Keywords Spirulina; High-temperature steam sterilization; Ultrahigh-pressure sterilization; Ultraciolet sterilization; Functional component; Antioxidant activity

螺旋藻是一種圓柱形螺旋狀的絲狀體微藻，不僅蛋白含量（60%）高，而且富含多糖、多不飽和脂肪酸、植物色素、維生素及微量元素等。王娜等[1]研究表明，螺旋藻蛋白質(zhì)數(shù)量高達2 085個，并發(fā)現(xiàn)蛋白超家族在抗氧化、抗癌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要功能。因此，螺旋藻是適合人們食用、保健、醫(yī)用的優(yōu)良微藻資源。市場上螺旋藻的加工產(chǎn)品形式多為螺旋藻粉、螺旋藻片，近幾年也有螺旋藻在飲料[2]、面條[3]、饅頭[4]、面包[5]以及復合片劑[6，7]等方面的應用研究。

目前，很多學者嘗試將螺旋藻與益生菌結(jié)合，開展螺旋藻發(fā)酵的相關研究[6，7]。益生菌發(fā)酵是開展螺旋藻深加工的良好途徑，可進一步提升螺旋藻的價值。發(fā)酵過程中，通常在接入菌種之前需要對物料進行滅菌，而滅菌對物料本身的品質(zhì)具有一定影響。在以往螺旋藻發(fā)酵相關的報道中，Bao等[8]在開展研究時使用紫外線滅菌藻粉的方法，韓慶等[9]在制作螺旋藻乳酸菌飲料時使用巴氏方法對螺旋藻進行滅菌處理，然而并沒有對滅菌方式進行特殊說明和比較研究。

為了保證滅菌后螺旋藻營養(yǎng)功效成分和活性，本研究對高溫蒸汽滅菌、超高壓滅菌和紫外線滅菌三種方法進行綜合比較，分析不同方法滅菌后乳酸菌發(fā)酵前后上清液和固形物中的成分差異，同時對發(fā)酵前后的上清液和固體物的抗氧化活性進行測定，旨在為螺旋藻益生菌發(fā)酵相關產(chǎn)品的開發(fā)和應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

螺旋藻購自鄂托克旗森泰螺旋藻有限公司;植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum DY-1）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei KDB-LC）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus KDB-03）為本實驗室分離保存菌種;凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans GIM1.645）購自廣東省微生物菌種保存中心。

1.2 主要試劑與儀器設備

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏購自北京奧博星生物技術有限公司，檸檬酸氫二銨[（NH4）2HC6H5O7]、葡萄糖（C6H12O6·H2O）、乙酸鈉（CH3COONa·3H2O）、磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）、硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、硫酸錳（MnSO4·H2O）、氯化亞鐵等購自國藥集團化學試劑有限公司;瓊脂粉購自北京索萊寶科技有限公司;抗壞血酸購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;菲啰嗪、蘆丁和沒食子酸購自Sigma-Aldrich;福林試劑（Folin-Ciocalteu）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

電子天平（JA5003），上海舜宇恒平科學儀器有限公司產(chǎn)品;超凈臺（YT-CJ-2D/B），北京亞泰科隆儀器技術有限公司產(chǎn)品;微生物培養(yǎng)箱（HZQ-X100），哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品;立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-75KB），上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品;超高壓設備（UHPF-750MPa），內(nèi)蒙古包頭科發(fā)新型高技術食品機械有限責任公司產(chǎn)品;超聲清洗儀（SB25-12 DTD），寧波新芝生物技術有限公司產(chǎn)品;電熱恒溫水浴鍋（DK-S24），上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品;超純水儀[FYY（40-120）01/02]，青島富勒姆科技有限公司產(chǎn)品;干燥箱（DHG-9030A），浙江賽德儀器設備有限公司產(chǎn)品;紫外可見分光光度計（756PC），上海舜宇恒平科學儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制 螺旋藻培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，螺旋藻干粉10 g，蒸餾水定容至 1 000 mL。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，檸檬酸氫二銨2 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH值為 6.2～6.6;固體培養(yǎng)基添加1.8%瓊脂，115℃滅菌20 min。

1.3.2 滅菌方法 高溫蒸汽滅菌：將上述培養(yǎng)基置藍口瓶中115℃滅菌20 min;超高壓滅菌，將上述培養(yǎng)基用聚乙烯塑料袋（13 cm×17 cm）密封，30℃、450 MPa處理10 min，通過無菌操作轉(zhuǎn)移至已滅菌藍口瓶中;紫外線滅菌：將螺旋藻干粉薄薄一層鋪在硫酸紙上，放置于超凈工作臺中距離紫外燈管30 cm處，過夜滅菌，通過無菌操作將其轉(zhuǎn)移至已經(jīng)滅菌的蒸餾水中（含2%葡萄糖）。將上述三種方法滅菌的螺旋藻培養(yǎng)基置室溫放置3 d后，無污染即可進行后續(xù)試驗。

1.3.3 樣品制備 將1.3.2中經(jīng)三種方法滅菌后樣品分為兩份。一份于5 000 r/min離心5 min分離上清液和固形物，其中固形物于45℃烘干，過80目篩，取1 g加入50 mL 70%乙醇溶液進行三次超聲萃取，超聲頻率20 kHz，超聲功率40 W，每次超聲時間10 min，分離上清液得到滅菌后固形物醇提液（20 mg/mL）。另一份經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后進行上清液和固形物分離，操作同上，分別得到發(fā)酵后上清液和發(fā)酵后固形物醇提液（20 mg/mL）。

1.3.4 乳酸菌發(fā)酵 取固體MRS培養(yǎng)基上的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum DY-1）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei KDB-LC）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus KDB-03）和凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans GIM1.645）分別接入MRS液體培養(yǎng)基，置32℃培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24 h，3 000 r/min離心5 min，棄上清用蒸餾水重懸，依次接入至1.3.2已滅菌的螺旋藻培養(yǎng)基，接種密度均為106 CFU/mL。32℃培養(yǎng)72 h，收集樣品進行處理。

1.4 測定指標及方法

參照文獻[10]的方法測定總酚、總黃酮含量，對總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、還原力和亞鐵離子螯合能力進行評價，部分指標陽性參照物更改為抗壞血酸（VC）。藻藍素：根據(jù)地方標準DB 53/T 186-2014檢測不同處理上清液和固形物中藻藍素的含量[11]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2010 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及作圖，SPSS 16.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行單因素方差（one-way ANOVA）統(tǒng)計分析，采用Duncans多重比較進行差異顯著性分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種滅菌方式及乳酸菌發(fā)酵對活性成分的影響

2.1.1 總黃酮 由圖1可以看出，發(fā)酵前，以高溫蒸汽滅菌的上清液中總黃酮含量最高，超高壓滅菌的含量最低;而固形物醇提液中則以超高壓滅菌的含量最高，高溫蒸汽滅菌和紫外線滅菌的含量無顯著差異。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，上清液和固形物醇提液中總黃酮含量下降，尤以高溫蒸汽滅菌的上清液中降幅最大，達60.0%。

2.1.2 總酚 由圖2可以看出，發(fā)酵前上清液中總酚含量以高溫蒸汽滅菌的最高，但經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后含量顯著下降，降幅達35.8%;超高壓滅菌和紫外線滅菌的總酚含量較低，但發(fā)酵后二者總酚含量均顯著增加。發(fā)酵前的固形物醇提液中總酚含量在三種滅菌方式下差別不大，發(fā)酵后的則以超高壓滅菌的增幅最大，達142.4%。

2.1.3 藻藍素 由圖3可以看出，發(fā)酵前后的上清液和固形物中藻藍素含量均以高溫蒸汽滅菌的最低，以超高壓滅菌的上清液中藻藍素含量最高，固形物中則以紫外線滅菌的最高。整體來看，乳酸菌發(fā)酵顯著降低了上清液和固形物中藻藍素的含量，其中上清液的降幅為38.0%～52.7%，固形物的降幅為64.0%～74.9%。

2.2 三種滅菌方式及乳酸菌發(fā)酵對抗氧化活性的影響

2.2.1 總抗氧化能力 由圖4可以看出，發(fā)酵前，上清液的總抗氧化能力以紫外線滅菌的最高，高溫蒸汽滅菌的最低;固形物醇提液的則以高溫蒸汽滅菌的最高，不同滅菌方式下差異顯著。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，超高壓滅菌和紫外滅菌的上清液總抗氧化能力下降，高溫蒸汽滅菌的上清液和固形物醇提液的抗氧化能力均顯著增加。其中，高溫蒸汽滅菌下，固形物醇提液的抗氧化能力顯著高于對照VC;相比發(fā)酵前，高溫蒸汽滅菌的上清液總抗氧化能力（OD695）提高幅度最大，達44.4%。

2.2.2 DPPH自由基清除能力 由圖5可以看出，發(fā)酵前，上清液的DPPH自由基清除能力以紫外線滅菌的最強，超高壓滅菌的次之，分別為90.5%、86.6%，而經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后二者的DPPH自由基清除能力均顯著下降。三種滅菌方式的固形物醇提液DPPH自由基清除能力無顯著差異，發(fā)酵后僅高溫蒸汽滅菌的DPPH自由基清除能力顯著下降。發(fā)酵前后上清液和固形物醇提液的DPPH自由基清除能力均顯著低于對照。

2.2.3 總還原力 由圖6可以看出，發(fā)酵前，上清液的還原力以高溫蒸汽滅菌的最高，超高壓滅菌的最低;經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后高溫蒸汽滅菌和紫外線滅菌的還原力顯著下降。不同滅菌方式固形物醇提液的還原力以高溫蒸汽滅菌的最低，超高壓滅菌和紫外線滅菌的還原力無顯著差異，而發(fā)酵后三者的還原力均顯著增加，以超高壓滅菌的增幅最大，達104.4%。發(fā)酵前后上清液和固形物提取液的還原力均顯著低于對照VC。

2.2.4 亞鐵離子螯合能力 由圖7可以看出，三種滅菌方式下，發(fā)酵前后上清液的亞鐵離子螯合能力均較弱;發(fā)酵前的固形物醇提液的亞鐵離子螯合能力與上清液的相當，而發(fā)酵后的則顯著增加，其中高溫蒸汽滅菌和超高壓滅菌的螯合能力提高至對照EDTA的59.6%～60.7%。

3 討論與結(jié)論

本研究利用高溫蒸汽滅菌、超高壓滅菌和紫外線滅菌三種方式，結(jié)合乳酸菌發(fā)酵，比較分析不同滅菌方式下螺旋藻發(fā)酵前后上清液和固形物中營養(yǎng)功效成分總黃酮、總酚、藻藍素的變化，并對抗氧化活性包括總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、還原力和亞鐵離子螯合能力等進行評價，得出發(fā)酵前，以高溫蒸汽滅菌的上清液中總黃酮和總酚含量最高，藻藍素最低;固形物醇提液中總黃酮含量則以超高壓滅菌最高，總酚和藻藍素含量以紫外線滅菌的最高。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，總黃酮和藻藍素含量下降，總酚含量除高溫滅菌的均增加。藻藍素是一種熱敏性物質(zhì)，在溫度高于60℃后明顯下降[12]。本研究采用的高溫蒸汽滅菌溫度高達115℃，采用此處理的藻藍素含量最低，與其結(jié)果一致。而超高壓處理上清液中藻藍素最高，這可能是由于超高壓處理能夠顯著減小螺旋藻粒徑，增加比表面積[13]，具有較好的破壁效果，從而促進了藻藍素的釋放。此外，乳酸菌發(fā)酵各處理的藻藍素含量均顯著下降，這可能是發(fā)酵過程中藻藍素發(fā)生降解所致[14]。

本研究選擇總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、還原力和亞鐵離子螯合能力等指標進行抗氧化活性評價。其中，抗氧化成分能夠?qū)o（Ⅵ）還原為Mo（Ⅴ），并且在酸性條件下形成綠色Mo（Ⅴ）的磷酸鹽，在波長695 nm處有強吸收，因此OD695值越大，就意味著抗氧化能力越強[15]。DPPH·在乙醇溶液中是一種穩(wěn)定的自由基，其孤對電子在517 nm處有強吸收，自由基清除劑可與孤對電子配對，降低其吸光度值，而降低的程度即可反映自由基清除能力[15]?？傔€原力是以普魯士藍[Fe4[Fe（CN）6]3]的生成量為指標進行評價，抗氧化物質(zhì)可將[K3Fe（CN）6]六氰合鐵酸鉀還原成K4Fe（CN）6，再利用Fe3+形成Fe4[Fe（CN）6]3，該物質(zhì)在波長700 nm處有強吸收[16]，OD700值越高說明樣品的還原力越強。此外，抗氧化物質(zhì)可通過金屬離子螯合劑的方式來阻止自由基鏈式反應，二價鐵離子與菲啰嗪結(jié)合形成紫色復合物，在波長562 nm處有強吸收，形成的紫色復合物越少，表明抗氧化物螯合鐵離子的能力越強。基于各指標的原理不同，可綜合評價螺旋藻不同滅菌方式和發(fā)酵前后的抗氧化活性。從本研究的抗氧化活性結(jié)果來看，三種滅菌方式之間抗氧化活性具有一定差異：乳酸菌發(fā)酵提高了高溫滅菌的上清液中總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力，高壓滅菌的還原力和亞鐵離子螯合能力;發(fā)酵后的固形物醇提液總抗氧化能力、還原力和亞鐵離子螯合能力均升高，DPPH自由基清除能力略有下降。

滅菌是進行純種發(fā)酵的前提，發(fā)酵培養(yǎng)目前常用的滅菌方法有巴氏滅菌、高溫蒸汽滅菌、超高壓滅菌等。我們曾采用巴氏殺菌處理培養(yǎng)基，過夜放置后污染嚴重，證實該殺菌方式不適用于螺旋藻。本研究認為超高壓滅菌和紫外線滅菌的最大優(yōu)勢是能夠較好地保留螺旋藻的標志成分藻藍素。盡管超高壓滅菌處理能夠較好地保證物料色、香、味等[17，18]，然而目前阻礙國內(nèi)發(fā)展超高壓食品加工技術的主要因素是設備成本高、投資巨大。同時，經(jīng)過多次預試驗發(fā)現(xiàn)紫外線殺菌處理通常需要12 h以上，但是被污染的概率仍然很大，考慮到染菌風險以及處理量，該方法并不適合生產(chǎn)上使用。綜合功效成分和抗氧化活性來說，高溫蒸汽滅菌發(fā)酵前后總酚和總黃酮活性成分以及抗氧化能力均可以保持在一定水平，且高溫蒸汽滅菌作為常規(guī)滅菌方法較為普及，成本相對較低。因此，我們認為在不單純以藻藍素為評價指標的情況下，可采用高溫蒸汽滅菌的方式進行螺旋藻的滅菌和后續(xù)加工，后期仍需對其營養(yǎng)成分和活性做進一步研究。

致謝：感謝浙江省林業(yè)科學院錢華研究員在螺旋藻培養(yǎng)基超高壓滅菌實驗環(huán)節(jié)給予的幫助。

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收稿日期：2019-06-13

基金項目：山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系藻類創(chuàng)新團隊建設專項（SDAIT-26-09）;山東省農(nóng)業(yè)科學院青年科研基金項目（2015YQN32）;山東省農(nóng)業(yè)科學院重大科技成果培育計劃項目（2015CGPY07）;國家國際科技合作專項（2012DFA30450）

作者簡介：劉云鵬（1987—），男，山東濟南人，碩士研究生，主要從事微藻的益生菌發(fā)酵研究。E-mail： 547169658@qq.com

通訊作者：于金慧（1985—），女，山東濟寧人，博士，助理研究員，主要從事微生物資源利用及功能性成分和生物活性研究。E-mail：faith_2002@163.com

畢玉平（1961—），男，山東青州人，博士，研究員，主要從事微藻培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物積累及活性研究。E-mail：yupingbi@vip.sina.com