佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江佳木斯 154007

隨著人們的生活水平日益提高，肉類食品已逐漸成為人們飲食結(jié)構(gòu)中重要的組成部分，尤其是香腸制品由于方便、快捷、口感好深受人們喜愛[1]。傳統(tǒng)香腸的制作工藝，需要添加亞硝酸鹽。亞硝酸鹽雖然能夠起到發(fā)色、抗氧化、改善質(zhì)構(gòu)和抑菌等作用[2]，但亞硝酸鹽能與肉中蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物胺類反應(yīng)，生成具有強烈致癌作用的亞硝胺[3]。隨著人們健康意識的增強，降低香腸中亞硝酸鹽的含量、提高食品安全性、生產(chǎn)更具營養(yǎng)價值的香腸已迫在眉睫[4，5]。

益生菌在發(fā)酵香腸生產(chǎn)領(lǐng)域的研究比較廣泛，具有代替和降解亞硝酸鹽的作用[6，7]。在發(fā)酵過程中，益生菌還能逐漸消耗肉中殘存的氧氣，從而降低氧化還原電勢，防止肉的腐爛和酸敗，同時賦予食品柔和的酸味和香氣，改進食品的品質(zhì)和營養(yǎng)，促進發(fā)酵香腸的成熟[8]。大量研究表明，不同乳酸菌在發(fā)酵肉制品過程中的作用效果和功能不同，且多菌種比單一菌種發(fā)酵效果好，亞硝酸鹽降解率高[9～11]。目前多菌種發(fā)酵香腸的研究雖有報道，但添加醪糟益生菌發(fā)酵香腸的研究尚未見報道。醪糟口味香甜醇美，含酒精量極低，富含維生素、葡萄糖、氨基酸等營養(yǎng)成分，有活氣養(yǎng)血、滋陰補腎、溫寒補虛、促進血液循環(huán)等功效[12]，其中的營養(yǎng)成分亦有助于益生菌的生長與代謝。添加醪糟旨在輔助益生菌降解亞硝酸鹽，同時提升香腸的風(fēng)味、營養(yǎng)價值與保健功效。本試驗以多菌種復(fù)配為發(fā)酵劑，并在發(fā)酵過程中添加醪糟，探究發(fā)酵溫度、益生菌接種量、發(fā)酵時間、醪糟添加量對香腸中亞硝酸鹽降解率和香腸感官品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 原料

雞胸肉、牛肉、淀粉、花椒、胡椒粉、食鹽、奶粉購買于佳木斯超市；

益生菌混合發(fā)酵劑由佳木斯大學(xué)發(fā)酵工程試驗室提供；

三聚磷酸鈉、亞硝酸鹽均為食品級。

1.1.2 試劑

飽和硼砂：分析純，哈爾濱化工化學(xué)試劑廠。

亞鐵氰化鉀：分析純,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

乙酸鋅：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

對氨基苯磺酸：分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

鹽酸萘乙二胺：分析純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所。

亞硝酸鹽：分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

冰乙酸：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

鹽酸：分析純，新海乳溶廠。

1.1.3 儀器

SPX-250B—Z型生化培養(yǎng)箱、YXQ—LS—75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

JP—040S超聲波振蕩器，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；

SpectrumLab22pc可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；

HH—Z2型恒溫水浴鍋，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

SW—CJ—2FD標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

AB104-S分析天平，METTLER TOLEDO Made in Switzerland；

HWS—250B恒溫恒濕箱，杭州艾普儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 香腸發(fā)酵工藝流程及操作要點

(1)工藝流程。

雞肉和牛肉→絞碎→加調(diào)味料→混勻→加醪糟、接種益生菌→混勻→灌裝→發(fā)酵→熟化。

(2)操作要點。

將腸衣先用溫水浸泡20min，然后放流水下沖洗，使其脫鹽，備用；灌腸時一定要松緊適度，使香腸均勻飽滿，不能過松或者過緊；香腸灌制完成后，在溫水中輕輕漂洗，洗去腸衣上附著的污物；把灌好的半成品香腸置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵(濕度均設(shè)置為95%)；把肉灌進腸衣后，用牙簽均勻的扎幾個小孔，排除肉里面的空氣，并且有利于腸內(nèi)的水分蒸發(fā)；于70℃恒溫蒸煮鍋熟化30min，冷卻，指標(biāo)測定。

1.2.2 香腸的配方

肉100g、淀粉5g、亞硝酸鹽15mg、胡椒粉0.2g、蒜5g、三聚磷酸鈉0.2g、鹽2g。

1.2.3 培養(yǎng)基及菌種活化

(1)活化培養(yǎng)基(1L)。

奶粉20g，蔗糖30g，用濃度為5%的豆?jié){定容至1 000mL，121℃滅菌15min。

(2)菌種的活化。

無菌操作，將保存的液體菌種按6%的接種量接入活化培養(yǎng)基中，封口，放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃活化培養(yǎng)48h，備用。

1.2.4 醪糟的制作及預(yù)處理

(1)醪糟的制作。

糯米→浸泡(24h)→蒸煮(隔水、110℃、30min)→冷卻→接種甜酒曲→保溫發(fā)酵(28℃、72h)→后熟(48h)。

(2)醪糟的預(yù)處理。

醪糟使用前用打漿機打成漿狀。

1.2.5 單因素試驗

(1)發(fā)酵溫度。

益生菌接種量為10%(以100g肉計)，醪糟添加量為15%，將半成品香腸分別置于20、25、30、37℃,4組溫度下進行發(fā)酵，發(fā)酵時間為24h，取出，熟化，進行感官評價并測定亞硝酸鹽含量。各組做3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。

(2)發(fā)酵時間。

益生菌接種量為10%，醪糟添加量為15%，將半成品香腸置于30℃的培養(yǎng)箱中，分別發(fā)酵6、12、18、24、36h，取出，熟化，進行感官評價并測定亞硝酸鹽含量。各組做3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。

(3)益生菌接種量。

（1）戊申將軍範(fàn)伯陽，庚申將軍華文陽，戊戌將軍範(fàn)少卿。（《太上說玄天大聖真武本傳神呪妙經(jīng)註》卷一，《中華道藏》30/538）1 30/538表示第30冊，第538頁。

醪糟添加量為15%，益生菌接種量分別為3%、5%、7%、10%，為了使香腸的水分活度一致，每組的加水量為(10%-接種量)×90%，置于30℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵24h，取出，熟化，進行感官評價并測定亞硝酸鹽含量。各組做3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。注：90%為活化培養(yǎng)基的含水量。

(4)醪糟添加量。

益生菌接種量為10%，醪糟添加量分別為10%、15%、20%、30%，為了使香腸的水分活度一致，每組的加水量為(30%-醪糟添加量)×70%，置于30℃的培養(yǎng)箱中發(fā)酵24h，取出，熟化，進行感官評價并測定亞硝酸鹽含量。各組做3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。注：70%為醪糟的含水量。

1.2.6 正交試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，對添加醪糟益生菌發(fā)酵香腸工藝進一步優(yōu)化。以降解率和感官評價為考量指標(biāo)，對發(fā)酵溫度、益生菌接種量、發(fā)酵時間、醪糟添加量進行4因素3水平L9(34)正交試驗。各組做3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗方案

1.2.7 指標(biāo)測定

(1)亞硝酸鹽殘留量的測定。

參照GB 5009.33—2016中分光光度法測定樣品中亞硝酸鹽含量[13]。圖1為亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)亞硝酸鹽降解率的計算。

X1——試樣中亞硝酸鈉的含量(mg/kg)；

100.93——加入150mg/kg食品級亞硝酸鹽的香腸未發(fā)酵前測得亞硝酸鹽的含量(mg/kg)。

(3)感官評價。

組織10位志愿者對香腸進行品嘗，按表2感官評價評分細(xì)則進行打分，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 發(fā)酵溫度

由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，亞硝酸鹽的降解率逐漸增大，說明升高溫度對益生菌降解亞硝酸鹽有促進作用，30℃與37℃時降解率較高；隨著發(fā)酵溫度的升高，感官評價得分呈正態(tài)分布，溫度為30℃時得分最高，此時香腸表面光滑、肉質(zhì)細(xì)膩，彈性好，顏色肉粉、有光澤，發(fā)酵香味適宜、有食欲；溫度為37℃時香腸肉質(zhì)略粗糙，彈性較弱，色澤與風(fēng)味欠佳；溫度低于30℃，香腸彈性、色澤、風(fēng)味均不及30℃好。綜合亞硝酸鹽的降解率和感官評價得分，發(fā)酵溫度30℃為宜。

表2 益生菌發(fā)酵香腸感官評價表

2.1.2 發(fā)酵時間

由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的延長，亞硝酸鹽的降解率逐漸增大，時長對降低亞硝酸鹽有正向影響，24h與36h時降解率較高；隨著發(fā)酵時間的延長，感官評價得分先升高后降低，24h時得分最高，此時香腸肉質(zhì)細(xì)膩、切面平整，彈性好，顏色肉粉、有光澤，發(fā)酵香味適宜、有食欲；與發(fā)酵時間為24h的香腸相比，其他發(fā)酵時間的香腸彈性不足，肉質(zhì)略粗糙、切面有孔隙，口感欠佳。綜合亞硝酸鹽的降解率和感官評價得分，發(fā)酵時間24h為宜。

2.1.3 益生菌接種量

由圖4可知，隨著益生菌接種量的增加，亞硝酸鹽的降解率逐漸增大，接種量為7%、10%、15%時，降解率增加不多；益生菌接種量由3%到15%時，感官評價得分逐漸增高，但分值相差不顯著。益生菌接種量不斷增加會導(dǎo)致生產(chǎn)成本大幅度提高，綜合考慮經(jīng)濟因素、亞硝酸鹽的降解率和感官評價得分，益生菌接種量10%為宜。此時香腸表面光滑、肉質(zhì)細(xì)膩、切面平整，彈性好，有光澤，發(fā)酵味較適宜。

2.1.4 醪糟添加量

由圖5可知，隨著醪糟添加量的增加，亞硝酸鹽的降解率和感官評價得分均呈正態(tài)分布。當(dāng)醪糟添加量為15%時，亞硝酸鹽的降解率和感官評價得分均最高，此時香腸肉質(zhì)細(xì)膩，顏色肉粉、有光澤，且發(fā)酵風(fēng)味最佳；醪糟添加量過高，則香腸肉質(zhì)粗糙，顏色偏白、光澤度降低；不添加醪糟或添加量過低，香腸的風(fēng)味與口感不足。所以綜合亞硝酸鹽的降解率和感官評價得分，醪糟添加量15%為宜。說明發(fā)酵香腸中添加適量醪糟，可以提高亞硝酸鹽的降解率，改善香腸的風(fēng)味口感。

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

2.2.1 降解率結(jié)果分析

正交試驗結(jié)果見表3。

表3 L9(34)正交試驗結(jié)果

由表3可知，通過比較R值RA>RC>RB>RD，4個因素對香腸亞硝酸鹽降解率的影響為：發(fā)酵溫度影響最大，其次為發(fā)酵時間、益生菌接種量，醪糟添加量影響最小。

A因素列：K3>K2>K1。B因素列：K3>K1>K2。C因素列：K3>K2>K1。D因素列：K2>K3>K1。由此可以得出正交試驗優(yōu)化的組合為A3B3C3D2(Y1)，即溫度30℃,益生菌接種量10%，時間24h，醪糟添加量15%降解率最大。

由表3直接得知：4號組合A3B1C3D2(Z1)降解率最高，即溫度30℃，益生菌接種量6%，時間24h，醪糟添加量15%。

2.2.2 感官評價結(jié)果分析

將9組香腸置于70～75℃的恒溫鍋中，熟化30min，冷卻至室溫，從組織狀態(tài)、彈性、色澤、風(fēng)味等方面進行感官評價，評價結(jié)果如表3。

由表3可知，通過比較R' 值RA'>RB'>RD'>RC'，4個因素對發(fā)酵香腸感官的影響為：發(fā)酵溫度影響最大，其次為益生菌接種量、醪糟添加量，發(fā)酵時間影響最小。

A因素列：K2'>K3'>K1'。B因素列：K3'>K2'>K1'。C因素列：K3'>K2'>K1'。D因素列：K3'>K2'>K1'。由此可以得出正交試驗優(yōu)化的組合為A2B3C3D3(Y2)，即溫度26℃，益生菌接種量10%，時間24h，醪糟添加量18%得分最高。

由表3直接得知：6號組合A2B3C1D2(Z2)得分最高，即溫度26℃，益生菌接種量10%，時間15h，醪糟添加量15%。

2.3 驗證性試驗結(jié)果

對正交試驗得出較好的4個組合，即Y1(A3B3C3D2)、Z1(A3B1C3D2)、Y2(A2B3C3D3)、Z2(A2B3C1D2)，做對比驗證試驗，結(jié)果如圖6。

由圖6可知，比較四組的降解率，最高為Y1組，最低為Z2組；比較四組的感官評價得分，最高為Z2組，其次為Y1組。比較Y1組與Z2組，雖然Z2組的感官評價得分高于Y1組，但Z2組的降解率最低。因此最佳組合為Y1組，即發(fā)酵溫度為30℃，益生菌接種量為10%，時間為24h，醪糟添加量為15%時，亞硝酸鹽的降解率高，且香腸表面光滑、肉質(zhì)細(xì)膩、切面平整，彈性好，顏色肉粉、有光澤，發(fā)酵香味適宜、有食欲。

3 討論與結(jié)論

本文通過單因素試驗和正交試驗，探究了發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、益生菌接種量和醪糟添加量對發(fā)酵香腸感官及亞硝酸鹽降解率的影響。得出發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時間24h、益生菌接種量10%、醪糟添加量15%時，亞硝酸鹽的降解率高，香腸的感官品質(zhì)好。

通過對比添加醪糟與未添加醪糟的發(fā)酵香腸，說明添加醪糟不僅對提高香腸的硬度、咀嚼性、彈性、色澤，改善發(fā)酵香腸的風(fēng)味質(zhì)量有一定的作用，同時對益生菌降解亞硝酸鹽有促進作用。

加水量對亞硝酸鹽的降解率及香腸的口感、組織狀態(tài)均有影響，進行單因素試驗和正交試驗時，由于益生菌接種量和醪糟添加量不同，帶入的水分不同，為了使香腸的水分活度一致，按比例添加了不同量的無菌水，避免水分活度不一致對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響。同時，進行溫度與時間的單因素試驗時發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵溫度過高、時間過長，會導(dǎo)致未熟化腸衣表面發(fā)黏，產(chǎn)生不良發(fā)酵氣味，出現(xiàn)顏色發(fā)白等現(xiàn)象。所以混合菌發(fā)酵香腸的發(fā)酵溫度不宜過高，發(fā)酵時間不宜過長。