胡志良,阿里木江·阿不拉,王偉,肖永彪
直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,2015年我國結(jié)直腸癌發(fā)病例數(shù)達37.6萬例,死亡例數(shù)達19.1萬例,嚴重危害我國人民健康[1]。目前直腸癌的治療方式包括手術(shù)、放化療及靶向藥物治療等,但對于中晚期患者治療效果不理想,易復發(fā)轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差[2]。由于直腸癌的病因及發(fā)病機制尚不明確,近年來對直腸癌發(fā)生發(fā)展分子機制的研究受到廣發(fā)關(guān)注。Twist基因位于7p21.1,編碼蛋白是具有特征性的螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)的Twist轉(zhuǎn)錄因子,其可形成同二聚體和異二聚體,與DNA 中E盒序列結(jié)合并調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過程,如調(diào)節(jié)神經(jīng)管閉合、肢體發(fā)育和棕色脂肪代謝等[3]。研究表明,在肺癌、肝癌等多種腫瘤中Twist表達升高,其能促進下游基因如E-鈣黏素(E-cadherin)表達降低,導致腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),腫瘤細胞浸潤、侵襲能力增強[4-5]。波形蛋白(Vimentin)位于10p13,該基因編碼Ⅲ型中間絲蛋白,與微管和肌動蛋白微絲一起構(gòu)成細胞骨架,功能上負責維持細胞質(zhì)的細胞形狀和完整性,并穩(wěn)定細胞骨架相互作用,還作為參與細胞粘附、遷移及信號傳導等許多其他重要生物學過程。研究表明,腫瘤細胞中核因子-κB等信號通路的激活能夠促進Vimentin表達升高,導致腫瘤細胞易發(fā)生局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移[6]。此外,在非小細胞肺癌中Twist表達與Vimentin表達呈有關(guān),兩者可能存在表達調(diào)控的關(guān)系,促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。本研究通過檢測直腸癌組織中Twist及Vimentin表達,分析兩者之間的相關(guān)性,初步探討其作用機制及臨床意義。
收集2016年1月至2019年3月間在我院診治的80例直腸癌患者的臨床病理資料。其中男性43例,女性37例;年齡29~76歲,平均年齡(53.2±6.1)歲;伴遠隔器官轉(zhuǎn)移19例,無遠隔器官轉(zhuǎn)移61例;腫瘤直徑:<5 cm者55例,≥5 cm者25例;腫瘤分期:Ⅰ~Ⅱ期58例,Ⅲ~Ⅳ期22例;分化程度:高分化19例,中分化30例,低分化31例;浸潤深度:肌層23例,漿膜層57例;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例。納入標準[7]:①經(jīng)病理檢查明確診斷為直腸腺癌;②患者既往未接受過放化療、免疫治療等;③患者臨床病理資料和隨訪相關(guān)資料完整。排除標準:①合并有急慢性腸炎、炎癥性腸病等消化系統(tǒng)疾病;②合并急性泌尿系感染、結(jié)核菌感染等感染性疾?。虎酆喜⑵渌鞴俚膼盒阅[瘤。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準通過。
應(yīng)用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測癌組織和癌旁正常組織中Twist及Vimentin的表達。將術(shù)中新鮮留取(離體30 min以內(nèi))的組織置于EP管中,液氮凍存后置于-80 ℃冰箱保存。取約50 mg的組織標本,應(yīng)用Trizol法提取組織中總RNA。以總RNA為模板,進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件:16 ℃ 30 min,42 ℃ 30 min,85 ℃5 min,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司,實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。Twist正向引物序列:5′-GTCCGCAGTCTTACGAGGAG-3′,反向引物序列:5′-GCTTGAGGGTCTGAATCTTGCT-3′;Vimentin正向引物:5′-GACGCCATCAACACCGAGTT-3′,反向引物序列:5′-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3′;內(nèi)參基因GAPDH的正向引物序列5′-CTGGGCTACACTGAG-CACC-3′,反向引物序列:5′-AAGTGGTCGTTGAGG-GCAATG-3′。qPCR反應(yīng)體系20 μL,包括模板cDNA 2 μL,正向及反向引物各1 μL,2×Taq PCR Master Mix 10 μL, 無RNA酶水6 μL。 Twist qPCR反應(yīng)條件94 ℃預(yù)變性10 min,94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共25個循環(huán)。Vimentin qPCR反應(yīng)條件為:96 ℃ 10 min,96 ℃ 30 s,70 ℃ 30 s,40個循環(huán)。每個樣本重復3次。Twist及Vimentin的相對表達量采用2-ΔCt法表示,目的基因Twist或Vimentin的表達水平相對于內(nèi)參基因GAPDH的比值為2-ΔCt,ΔCt=CtTwist/Vimentin-CtGAPDH。
直腸癌組織中Twist的相對表達量為1.081±0.115,顯著高于癌旁組織的0.213±0.051(t=60.713,P=0.000);直腸癌組織中Vimentin的相對表達量為2.138±0.216,顯著高于癌旁組織的1.037±0.134(t=38.741,P=0.000);見圖1。
圖1直腸癌組織與癌旁組織Twist、Vimentin表達比較
直腸癌組織中Twist、Vimentin的表達與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),而與性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤分化程度及漿膜浸潤無關(guān),見表1。
Pearson線性相關(guān)分析結(jié)果表明,直腸癌癌組織中Twist的mRNA的相對表達量與Vimentin的mRNA的相對表達量呈明顯正相關(guān)(r=0.613,P=0.009),見圖2。
表1直腸癌組織中Twist、Vimentin表達與患者臨床病理特征的關(guān)系
圖2直腸癌組織中Twist與Vimentin表達的相關(guān)性
近年來隨著我國人民生活水平的提高,直腸癌的發(fā)病率逐漸升高,我國每年新發(fā)病例數(shù)約占全球發(fā)病例數(shù)的18%,嚴重威脅我國人民健康[8]。直腸癌的局部解剖結(jié)構(gòu)復雜,手術(shù)難度較大,術(shù)后并發(fā)癥及復發(fā)率較高,特別是對于局部進展期及晚期患者,患者死亡率較高,預(yù)后較差[9]。因此需對直腸癌的發(fā)生和發(fā)展機制進行深入研究,尋找具有臨床意義的腫瘤標志物。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是使處于靜止穩(wěn)定狀態(tài)的上皮細胞能夠以單細胞的形式獲得遷移和侵入的能力的過程。大量研究表明,腫瘤細胞EMT重新激活,腫瘤細胞分子表型發(fā)生改變,上皮性表型特征的部分喪失,而部分獲得間充質(zhì)表型,促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。
Twist又稱Twist家族bHLH轉(zhuǎn)錄因子1,含有特征性的bHLH結(jié)構(gòu)域,能夠結(jié)合靶基因的DNA序列,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。Twist能夠誘導腫瘤干細胞的形成促進腫瘤發(fā)生、促進原發(fā)性腫瘤生長及腫瘤轉(zhuǎn)移。研究表明,Twist在多種腫瘤中過表達,Twist的過度表達誘導EMT,促進腫瘤轉(zhuǎn)移形成,靶向藥物抑制Twist及下游相關(guān)分子能夠明顯抑制腫瘤生長、限制腫瘤轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)耐藥性,從而提高癌癥患者的存活率[11]。本研究中,直腸癌組織中Twist的mRNA的相對表達量明顯高于癌旁正常組織,目前其具體調(diào)控機制尚不清楚,可能與腫瘤微環(huán)境中免疫細胞、腫瘤細胞間釋放的TNF、TGF-β等細胞因子增多有關(guān)。研究表明,TNF、TGF-β等能結(jié)合于腫瘤細胞表面的相應(yīng)受體,激活相應(yīng)細胞信號傳導通路,如核因子κB通路等,促進Twist的表達[12]。本研究中直腸癌組織中Twist的表達與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),表明Twist表達與直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。一方面,Twist表達水平升高能夠直接結(jié)合并抑制細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A(ARF)的表達,從而抑制P53凋亡信號通路,導致腫瘤細胞過度增殖,凋亡減少,腫瘤分期升高[13]。另一方面,腫瘤細胞中Twist的表達升高后,通過調(diào)節(jié)鈣粘蛋白家族的表達,影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展,如腫瘤細胞表面N-鈣黏素表達降低,導致細胞間粘附能力下降,促進腫瘤細胞的淋巴或血行轉(zhuǎn)移[14]。
Vimentin是中間絲蛋白家族的主要成分,在正常間充質(zhì)細胞中普遍表達,維持細胞完整性及抗應(yīng)激性。Vimentin是EMT的重要標志物之一,在多種惡性腫瘤中過表達,包括前列腺癌、胃腸道腫瘤、乳腺癌及肺癌等[15]。腫瘤中Vimentin的過度表達與腫瘤增殖、侵襲和患者預(yù)后不良密切相關(guān),因而有可能作為腫瘤診斷、治療的潛在靶標。本研究中,直腸癌組織中Vimentin的相對表達量顯著高于癌旁組織,其機制可能是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制異常有關(guān)。研究表明,腫瘤發(fā)生時負性調(diào)控Vimentin表達的微小RNA -145表達下調(diào),Vimentin的mRNA穩(wěn)定性增加,導致Vimentin的表達水平增加[16]。此外,本研究中,直腸癌組織中Vimentin的相對表達量與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),較高腫瘤分期及伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中Vimentin表達明顯較高。Vimentin在正常生理條件下維持間充質(zhì)細胞的可塑性,而在腫瘤中具有促進腫瘤細胞遷移的作用,機制可能是Vimentin通過整合來自環(huán)境的機械輸入信號并調(diào)節(jié)微管和肌動球蛋白網(wǎng)絡(luò)的動力學來促進細胞遷移,促進癌細胞局部侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[17-18]。本研究進一步研究直腸癌癌組織中Twist與Vimentin表達的相關(guān)性,結(jié)果兩者表達呈顯著正相關(guān),表明兩者可能存在直接或間接的相互作用關(guān)系。研究表明,腫瘤細胞中轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路激活后,促進Twist等轉(zhuǎn)錄因子的表達,Twist能夠直接結(jié)合Vimentin啟動子區(qū),并促進間質(zhì)性表型Vimentin的表達,發(fā)揮促進腫瘤細胞惡性進展和轉(zhuǎn)移能力[19-20]。
綜上所述,直腸癌組織中Twist與Vimentin均表達升高,兩者表達呈明顯正相關(guān),且均與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),有可能成為新的直腸癌診斷、治療及預(yù)后評估的腫瘤標志物,但對于兩者之間具體相互作用及調(diào)控機制有待進一步研究。