何淑兵，左東明，張文山，劉博，智英輝，張國栓

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在我國各種惡性腫瘤中發(fā)病率居第二位[1]。全球每年新發(fā)胃癌病例100多萬，死亡約80多萬，其發(fā)病有明顯的地域差別，其中東南亞地區(qū)發(fā)病率最高，中國每年新發(fā)胃癌病例占全球的42%，死亡占35%[2]。因此，深入研究胃癌發(fā)生發(fā)展的機制，尋找診斷新的標志物和治療新靶點，對防治胃癌提高人們的生活質(zhì)量具有重要價值。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，微小型RNA(microRNA,miRNA)是一種新的基因調(diào)控元件，其長度約為22個堿基的單鏈RNA，不具有編碼蛋白的功能，可以使其靶基因降解或阻礙其靶基因的翻譯來調(diào)控其靶基因的表達[3]，從而參與調(diào)控細胞增殖、凋亡、干細胞分化、腫瘤血管生成、神經(jīng)元發(fā)育、腫瘤細胞浸潤和轉(zhuǎn)移等一系列生命活動。研究發(fā)現(xiàn)，通過對胃癌細胞及正常胃黏膜上皮細胞體外培養(yǎng)并提取RNA進行miRNA芯片分析發(fā)現(xiàn),與正常胃黏膜細胞相比miR-648在胃癌細胞中上調(diào)表達[4]，對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織應(yīng)用qRT-PCR檢測RNA芯片測定的miRNA結(jié)果，證實miR-648在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中明顯上調(diào)[5]，但miR-648對胃癌細胞生物行為的影響及其具體分子機制目前還未見報道。因此，本課題就miR-648對胃癌細胞的生物學(xué)影響及其具體分子機制進行研究，以期為胃癌的早期診斷和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

胃癌SGC-7901、MGC-803細胞系和正常胃黏膜上皮GES-1細胞購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物寶藏委員會細胞庫；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和DMEM試劑購自Gibco；Trizol總RNA提取試劑購于Invitrogen；RT Profiler PCR Array Kit購于Qiagen；Fast Start Universal SYBR Green Master購于Roche；胰蛋白酶購于Sigma；抗β-actin 抗體購于杭州聯(lián)科生物科技有限公司；Transwell小室購于Millipore；CCK-8購于Dojindo；細胞凋亡試劑盒購于南京凱基公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 采用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)細胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。選擇對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 real-time PCR法檢測RNA的表達 根據(jù)Trizol法提取總RNA,按照PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒說明書進行操作合成cDNA。MiR-648-F: 5′-GGAAGTGTGCAGGGC-3′, MiR-648-R-5′-AGTGCGTGTCGTGGAGTC-3′,脾酪氨酸激酶Syk-F:5′-TTTCGGACTTTCCAAAGCACTGCG-3′, Syk-R:5′-ACTCCAAAGCTCCAGACATCCTGT-3′。U6作為內(nèi)參，U6-F: 5 ′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 ′；U6-R:5′-CGCTT-CACGAATTTGCGTGTCAT-3′。根據(jù)SYBR Green I PCR 檢測試劑盒說明書在ABI7500熒光定量PCR儀中進行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火32 s,70 ℃延伸30 s,循環(huán)40次。溶解曲線分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s。2-ΔΔCt法測定各基因mRNA的相對表達水平。每個樣品孔重復(fù)檢測3次，取均值。

1.2.3 Western blot 檢測相關(guān)蛋白的表達 收集各組細胞，用RIPA細胞裂解液裂解提取各組總蛋白并用BCA法定量。取適量蛋白上樣后進行SDS-PAGE,電轉(zhuǎn)至PVDF膜后加入5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2 h,孵育相應(yīng)一抗，4 ℃條件下孵育過夜，洗膜室溫孵育相應(yīng)二抗2 h,洗膜后用化學(xué)發(fā)光試劑盒對PVDF進行曝光顯影，以(-actin為內(nèi)參，后采用成像掃描分析系統(tǒng)測定條帶的灰度值。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染 收集對數(shù)生長期的胃癌SGC-7901細胞，適當(dāng)密度接種到6孔上，待細胞融合到70%時，按照LipofectmineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將干擾miR-648的模擬物anti-miR-648和其陰性對照anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至SGC-7901細胞中，分別標記為anti-miR-648組和anti-miR-NC組。轉(zhuǎn)染4 h后換為含血清的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果。后續(xù)實驗中將SGC-7901隨機分為miR-648組(轉(zhuǎn)染過表達miR-648模擬物)、miR-NC(轉(zhuǎn)染過表達miR陰性對照)、anti-miR-648+si-Syk組(干擾miR-648表達的模擬物和沉默Syk的siRNA共轉(zhuǎn)染)、anti-miR-648+si-NC組(干擾miR-648表達的模擬物和沉默Syk的陰性對照共轉(zhuǎn)染)四組，采用上述方法轉(zhuǎn)染后進行后續(xù)實驗。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期的細胞懸液，按每孔2×103個接種到96孔板，待細胞貼壁后每孔加入CCK-8溶液15 μL,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱重培養(yǎng)2 h,用酶標儀檢測490 nm的吸光度。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集各組待測細胞，離心漂洗去上清，根據(jù)Annexin V-FITC 試劑盒處理細胞，簡述步驟如下：緩沖液重懸細胞搖勻，避光孵育15 min后加入Annexin V-FITC, 再次避光孵育15 min后采用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。

1.2.7 Transwell法檢測細胞遷移和侵襲 細胞遷移實驗如下：Transwell小室在鋪板前30 min浸潤在無血清培養(yǎng)基中，細胞消化后計數(shù)，每孔2×103個，小室內(nèi)無血清，培養(yǎng)板內(nèi)有血清，培養(yǎng)24 h后5%多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗后結(jié)晶紫染色10 min，PBS沖洗后用倒置顯微鏡拍照。細胞侵襲實驗在實驗前用20 mg/L Matrigel 1∶3稀釋包被Transwell小室底部膜上室面，4 ℃風(fēng)干后步驟同細胞遷移實驗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 胃癌細胞中miR-648表達上調(diào)、Syk表達下調(diào)

圖1和表1顯示，與正常胃黏膜上皮細胞GES-1細胞相比，胃癌SGC-7901、MGC-803細胞中miR-648的表達量明顯上調(diào)，Syk mRNA和蛋白的表達量明顯下調(diào)(P<0.05)。

圖1Syk蛋白的表達

2.2 抑制miR-648表達抑制了胃癌SGC-7901細胞增殖并促進其細胞凋亡

圖2顯示，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-648組細胞的凋亡率和Bax蛋白的表達量顯著上升，Bcl-2蛋白的表達量顯著下降(P<0.05)。表2顯示，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-648組胃癌SGC-7901細胞中miR-648的表達量顯著下降(P<0.05)，可見，成功轉(zhuǎn)染了抑制miR-648表達的胃癌SGC-7901細胞。轉(zhuǎn)染24 h后，anti-miR-648組與anti-miR-NC組的細胞活性無顯著差異，轉(zhuǎn)染48 h和72 h后， anti-miR-648組細胞活性較anti-miR-NC組顯著下降；anti-miR-648組較anti-miR-NC組Cyclin D1的表達量明顯下降,P21蛋白的表達量明顯上升(P<0.05)。

表1miR-648和Syk在 SGC-7901、MGC-803細胞和GES-1細胞中的表達

注：與GES-1組比較，*P<0.05

2.3 抑制miR-648表達抑制了胃癌SGC-7901細胞遷移和侵襲

圖3和表3顯示，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-648組細胞遷移和侵襲的數(shù)目顯著下降，E-cadherin蛋白的表達量顯著升高，MMP-2蛋白的表達量顯著下降(P<0.05)?？梢?，抑制miR-648的表達對胃癌SGC-7901細胞的遷移和侵襲具有抑制作用。

圖2抑制miR-648對胃癌細胞SGC-7901凋亡及增殖、凋亡蛋白表達的影響

表2抑制miR-648對胃癌細胞SGC-7901增殖、凋亡的影響

圖3抑制miR-648對胃癌細胞SGC-7901遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達的影響

2.4 miR-648可靶向抑制Syk的表達

圖4A為TargetScan(http://www.targetscan.org/)軟件預(yù)測結(jié)果示意圖，表明miR-648與Syk存在互補結(jié)合位點。表 4為雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果，同miR-NC與WT-Syk共轉(zhuǎn)染相比，miR-648與WT-Syk共轉(zhuǎn)染后，SGC-7901細胞的熒光素酶活性顯著下降(P<0.05)；但miR-NC、miR-648分別與MUT-Syk共轉(zhuǎn)染后，SGC-7901細胞的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計意義(P<0.05)，可見miR-648對Syk具有靶向作用。表5顯示，與miR-NC組相比，miR-648組中Syk mRNA和蛋白的表達量顯著下降(P<0.05)；相反，anti-miR-648組中Syk mRNA和蛋白的表達量較anti-miR-NC組顯著升高(P<0.05)，可見miR-648可負向調(diào)控Syk的表達。

表3抑制miR-648對胃癌細胞SGC-7901遷移、侵襲的影響

圖4Syk的3′UTR中含有miR-648的互補核苷酸鏈

2.5 沉默Syk可逆轉(zhuǎn)抑制miR-648對胃癌細胞SGC-7901增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

圖5和表6-7顯示，與 anti-miR-NC組相比，anti-miR-648組中Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2蛋白的表達量明顯下降,Syk、P21、Bax、E-cadherin蛋白的表達量明顯上升；轉(zhuǎn)染24 h后，anti-miR-648組與anti-miR-NC組的細胞活性無顯著差異，轉(zhuǎn)染48 h和72 h后， anti-miR-648組細胞活性較anti-miR-NC組顯著下降；anti-miR-648組較anti-miR-NC組細胞的凋亡率明顯上升，細胞和侵襲數(shù)目明顯下降(P<0.05)。與anti-miR-648+si-NC組相比，anti-miR-648+si-Syk組中Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2蛋白的表達量明顯上升,Syk、P21、Bax、E-cadherin蛋白的表達量明顯下降；轉(zhuǎn)染24 h后，anti-miR-648組與anti-miR-NC組的細胞活性無顯著差異，轉(zhuǎn)染48 h和72 h后， anti-miR-648組細胞活性較anti-miR-NC組顯著上升；anti-miR-648組較anti-miR-NC組細胞的凋亡率明顯下降，細胞和侵襲數(shù)目明顯上升(P<0.05)。綜上所述，抑制Syk表達能夠逆轉(zhuǎn)抑制miR-648對胃癌細胞SGC-7901增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。

表4雙熒光素酶報告實驗

表5miR-648調(diào)控Syk的表達

注：與miR-NC組比較，aP<0.05；與anti-miR-NC組比較，bP<0.05

圖5Syk及增殖、凋亡、遷移、侵襲蛋白的表達

表6抑制Syk表達能夠逆轉(zhuǎn)抑制miR-648對胃癌細胞SGC-7901增殖、凋亡的影響

注：與anti-miR-NC組比較，aP<0.05；與anti-miR-648+si-NC組比較，bP<0.05

表7抑制Syk表達能夠逆轉(zhuǎn)抑制miR-648對胃癌細胞SGC-7901遷移、侵襲的影響

注：與anti-miR-NC組比較，aP<0.05；與anti-miR-648+si-NC組比較，bP<0.05

3 討論

胃癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其有高發(fā)病率、高死亡率、預(yù)后差的特點，嚴重威脅到人類健康[6]。目前手術(shù)根治是胃癌的主要治療方法，早期患者術(shù)后5年生存率可達90%多，但因胃癌早期癥狀不明顯及常規(guī)胃鏡檢查普及不足等原因，很大一部分患者在確診時就已經(jīng)處于胃癌進展期，錯過了最佳手術(shù)治療時間，5年生存率僅為20%左右[7]?，F(xiàn)有胃癌治療手段有限，單純手術(shù)治療的總生存率較低，放療和化療未能產(chǎn)生顯著效果多用于術(shù)前術(shù)后輔助治療，我國每年因胃癌去世的患者近352 300人[8]。因此，急需尋找到一種療效好、不良反應(yīng)小的新型治療方法應(yīng)對胃癌發(fā)病率和死亡率日益增長的現(xiàn)狀。

大量研究表明，微小型RNA(microRNA，miRNA)是腫瘤發(fā)生發(fā)展中重要的參與者，已成為腫瘤研究中的熱點。miRNA通過與靶基因的3′UTR完全互補切割靶基因的mRNA或不完全互補抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控一系列重要生命過程[9]，包括細胞的增殖、分化、凋亡、腫瘤細胞的浸潤及轉(zhuǎn)移等[10]，在多種腫瘤中發(fā)揮作用，如張等人發(fā)現(xiàn)miR-648在前列腺癌中上調(diào)表達，并鑒定miR-648為新的候選前列腺癌miRNA生物標志物[11]，Simone kreth 等人鑒定miR-648為膠質(zhì)母細胞瘤中MGMT的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子[12]。據(jù)研究報道，miR-648在胃癌細胞中表達上調(diào)[4-5]，但其對胃癌細胞的具體生物學(xué)影響還未見報道。本課題通過RT-PCR法和Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，與正常胃黏膜上皮細胞相比，胃癌細胞中miR-648的表達顯著上調(diào)，與此前研究結(jié)論[4-5]一致，提示其可能起到促癌基因的作用。抑制miR-648的表達則細胞活性及遷移、侵襲數(shù)目顯著下降，凋亡率顯著升高，且Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2蛋白的表達量明顯下降，P21、Bax、E-cadherin蛋白的表達量顯著上升。結(jié)果證明抑制miR-648的表達抑制胃癌的增殖、遷移和侵襲，促進其細胞的凋亡，但其具體分子機制尚不清楚。

本課題通過生物信息預(yù)測發(fā)現(xiàn)Syk可能是miR-648的靶基因， miR-648與Syk的3′UTR之間存在互補結(jié)合的核苷酸位點。脾酪氨酸激酶(Spleen Tyrosine Kinase,Syk)是非受體型蛋白酪氨酸激酶，在造血細胞、成纖維細胞、淋巴細胞、血管內(nèi)皮細胞中廣泛存在，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用[13]。近年研究表明，Syk的表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可以抑制多種惡性腫瘤的生長[14-16]，如Syk可抑制乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移[17]，抑制大腸癌大腸癌的浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分化等[18]。 研究發(fā)現(xiàn)Syk在胃癌組織中下調(diào)表達，Syk的表達缺失與胃癌的生長和轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)聯(lián)性[19-20]，并有研究證明Syk對胃癌的生長轉(zhuǎn)移有抑制作用，Syk可誘導(dǎo)胃癌組織中腫瘤細胞的凋亡[21]。熒光素酶基因報告實驗和Western blot實驗進一步證實miR-648可靶向調(diào)控Syk的表達，提示SKY是miR-648的下游靶基因。此外，研究還發(fā)現(xiàn)沉默Syk可逆轉(zhuǎn)抑制miR-424對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，間接證實兩者之間存在調(diào)控關(guān)系。

綜上所述，本課題明確了miR-648對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，并初步探討了miR-648可通過負調(diào)控Syk發(fā)揮抗腫瘤的作用機制，為胃癌的早期診斷和臨床治療提供了可靠的理論依據(jù)和新的治療思路。