譚林，王騫，屈偉明，艾瓊嘉，陳維順,黃美園

胃癌是嚴(yán)重威脅人類生存和健康的惡性腫瘤，我國是全世界胃癌的高發(fā)地域之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國胃癌無論發(fā)病率還是死亡率均高居所有惡性腫瘤前三位[1]。由于早期癥狀不明顯，大部分患者胃癌確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者不良預(yù)后。幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)感染易引起慢性胃炎和消化性潰瘍，已被WHO作為Ⅰ類致癌因素[2]。研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌的毒力因子CagA在胃黏膜上皮細(xì)胞可通過激活NF-κB通路發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，如炎性，細(xì)胞永生化，細(xì)胞增殖，抗凋亡，血管新生，上皮細(xì)胞延伸和極性的喪失誘發(fā)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)導(dǎo)致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等，與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。磷酸化p65(p-p65)是NF-κB信號通路重要組成部分，可作為NF-κB信號傳導(dǎo)通路活化的標(biāo)志[5]。本研究通過檢測胃癌和癌旁正常組織中H.pylori感染情況及p-p65、EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討胃癌組織中H.pylori感染和p-p65、EMT相關(guān)蛋白表達(dá)之間的關(guān)系及其臨床意義，有望為胃癌轉(zhuǎn)移的預(yù)測、診斷和藥物或生物治療提供新的線索。

1 對象與方法

1.1 標(biāo)本收集

收集中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院2014年8月至2016年5月普外科胃癌根治手術(shù)切除標(biāo)本115例，癌旁正常胃組織標(biāo)本20例(均為手術(shù)切緣，病理證實(shí)無癌浸潤)?；颊咝g(shù)前均未接受放、化療，所有標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)，且已通過Giemsa染色法檢測法判斷患者是否有H.pylori感染。其中陽性68例，陰性47例，男性82例，女性33例，年齡35～86歲(平均年齡61.0歲)?；颊邔Ρ緦?shí)驗(yàn)均知情，組織標(biāo)本的獲取和使用均獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)同意。胃癌組織根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)第7版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床TMN分期，浸潤深度按照UICC標(biāo)準(zhǔn)中的T分期標(biāo)準(zhǔn)確定，依據(jù)病理標(biāo)準(zhǔn)確認(rèn)分化程度。所有標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定后，脫水、透明、浸蠟包埋，制成4 μm厚連續(xù)切片。

1.2 試劑

兔抗人p-p65(Ser536)多克隆抗體(ab86299)購自英國Abcam公司，鼠抗人E-cadherin單克隆抗(MAB-0738)、鼠抗人Vimentin單克隆(MAB-0738)抗均購自福州邁新公司。SP試劑盒、DAB顯色劑、中性樹膠封片劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。二甲苯、無水酒精、石蠟、PBS緩沖液、枸櫞酸鈉緩沖液購自廣州瑞斯生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化染色

常規(guī)脫蠟、水化，枸櫞酸高壓修復(fù)2.5 min，H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，正常山羊血清封閉，滴加一抗(p-p65濃度為1∶800，Vimentin和E-cadherin均為抗體原液)，孵育過夜。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，顯微鏡鏡檢及圖像采集分析。

1.4 結(jié)果的判斷

H.pylori感染的判斷：Giemsa染色后在顯微鏡下觀察，胃小凹及腺腔有“S”形分布的紅色顆粒為H.pylori感染陽性，否則為H.pylori感染陰性。

免疫組化結(jié)果判斷：由病理科醫(yī)師雙盲閱片，以胞膜/胞質(zhì)/胞核中出現(xiàn)黃色或黃褐色顆粒視為免疫組織化學(xué)染色陽性。免疫組化計(jì)分包括染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞比例確定。按染色強(qiáng)度分級：無染色或與背景一致的淺黃色為0分，黃色記1分，棕黃色記2分，黃褐色記3分。按陽性細(xì)胞比例分級：每片隨機(jī)觀察5個高倍鏡視野(200×)，計(jì)算染色陽性細(xì)胞所占比例：陽性細(xì)胞數(shù)<5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，>50%計(jì)3分。每張切片得分由染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞比例評分相加所得，0～3分判定為陰性表達(dá)，4～6分判定為陽性表達(dá)。

1.5 隨訪

通過電話及門診對患者進(jìn)行隨訪，所有患者均隨訪至2019年7月或至患者死亡，所有患者隨訪資料完整。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和癌旁正常胃組織中H.pylori感染及p-p65、Vimentin和E-cadherin的表達(dá)情況

p-p65主要表達(dá)于胞質(zhì)和胞核，Vimentin主要表達(dá)于胞質(zhì)，E-cadherin主要表達(dá)于胞質(zhì)與胞膜。胃癌組織中H.pylori感染率(59.1%)和p-p65、Vimentin陽性表達(dá)率(60.0%、34.8%)明顯高于癌旁正常組織(30.0%和35.0%、0.0%)，而胃癌組織中E-cadherin陽性表達(dá)率(53.9%)明顯低癌旁正常組織(100%)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；且p-p65和Vimentin在H.pylori感染陽性胃癌組織中的表達(dá)高于H.pylori感染陰性胃癌組織和癌旁正常組織，E-cadherin在H.pylori感染陽性胃癌組織中的表達(dá)低于H.pylori感染陰性胃癌組織和癌旁正常組織(圖1、表1)。

圖1p-p65、Vimentin和E-cadherin分別在H.pylori感染陽性胃癌組織、H.pylori感染陰性胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)(SP，×200) A、D、G分別為p-p65、Vimentin和E-cadherin在H.pylori感染陽性胃癌組織中的表達(dá)；B、E、H分別為p-p65、Vimentin和E-cadherin在H.pylori感染陰性胃癌組織中的表達(dá)；C、F、I分別為p-p65、Vimentin和E-cadherin在癌旁正常組織中的表達(dá)

表1胃癌和癌旁正常組織中H.pylori感染及p-p65、Vimentin和E-cadherin的表達(dá)

2.2 H.pylori感染及p-p65、Vimentin和E-cadherin的表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

胃癌組織中，H.pylori感染和p-p65的表達(dá)與TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度無相關(guān)性；Vimentin和E-cadherin的表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，同時Vimentin的表達(dá)還與分化程度有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡無明顯相關(guān)性(表2)。

表2H.pylori感染及p-p65、Vimentin和E-cadherin在胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 胃癌組織中H.pylori感染與p-p65、Vimentin和E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性

對115例胃癌組織中H.pylori感染與p-p65、Vimentin和E-cadherin的表達(dá)采用Spearman等級相關(guān)分析，結(jié)果顯示：H.pylori感染與p-p65、Vimentin的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(rs=0.585，P=0.000、rs=0.260，P=0.005)，而與E-cadherin的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(rs=-0.343，P=0.000)，見表3。

2.4 胃癌組織中p-p65與Vimentin和E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性

對115例胃癌組織中p-p65與Vimentin和E-cadherin的表達(dá)采用Spearman等級相關(guān)分析，結(jié)果顯示：p-p65與Vimentin的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(rs=0.298，P=0.001)，而與E-cadherin的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(rs=-0.292，P=0.002，表4)。

表3胃癌組織中H.pylori感染與p-p65、Vimentin和E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性分析

2.5 胃癌組織中H.pylori感染、p-p65、Vimentin和E-cadherin的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

115例患者隨訪36～60個月，均獲得完整隨訪資料，通過Kaplan-Meier生存曲線及Log-rank檢驗(yàn)比較胃癌患者中H.pylori感染、p-p65、Vimentin和E-cadherin的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系(圖2)。分析顯示：有H.pylori感染及p-p65和Vimentin陽性表達(dá)患者總生存率明顯低于陰性表達(dá)患者(P=0.017、P=0.011、P=0.022)，E-cadherin陰性表達(dá)患者總生存率明顯低于陽性表達(dá)患者(P<0.001)。Cox多因素回歸分析顯示：TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、H.pylori感染及E-cadherin表達(dá)陰性是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素(P<0.05)，見表5。

表4p-p65與Vimentin和E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性分析

圖2H.pylori感染、p-p65、Vimentin和E-cadherin的表達(dá)對胃癌患者生存期的影響

表5影響胃癌患者預(yù)后的Cox多因素回歸分析

3 討論

我國是胃癌大國，雖然近年來發(fā)病率有所下降，但其在各類惡性腫瘤發(fā)病率與死亡率仍高居第二位。大部分患者一經(jīng)確診便已是中晚期，喪失了手術(shù)根治的最佳時機(jī)，對患者的生命健康安全造成了嚴(yán)重影響。侵襲轉(zhuǎn)移是影響胃癌預(yù)后的關(guān)鍵因素，是導(dǎo)致胃癌患者死亡的主要原因。

大量研究表明[6]，EMT是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。EMT是指上皮細(xì)胞失去極性以及基膜連接等上皮表型，轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的生物學(xué)過程。通過發(fā)生EMT，腫瘤細(xì)胞可以獲得更好的運(yùn)動、侵襲和抵抗凋亡刺激，并且EMT還可驅(qū)動腫瘤細(xì)胞獲得干性潛能，從而實(shí)現(xiàn)自我更新、腫瘤起始和化療抵抗等[7]。EMT的主要分子特征：上皮細(xì)胞標(biāo)記物，如E-cadherin表達(dá)下調(diào)、β-catenin從胞膜到胞核易位表達(dá)；間質(zhì)表型標(biāo)記物，如波形蛋Vimentin、纖連蛋白Fibronectin等表達(dá)上調(diào)[8]。因此，可以通過檢測這些標(biāo)志物來鑒定EMT的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，Vimentin在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，而E-cadherin則正好相反。同時Vimentin與E-cadherin的表水平與腫瘤大小、浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，Vimentin與腫瘤分化程度亦有關(guān)性。生存分析提示Vimentin表達(dá)陽性患者的生存率明顯低于Vimentin表達(dá)陰性患者，E-cadherin則正好相反；多因素Cox回歸分析顯示：E-cadherin表達(dá)陰性是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素。由此可見，EMT在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，且影響患者的預(yù)后。

NF-κB是炎癥向腫瘤轉(zhuǎn)變過程中的一個關(guān)鍵分子，己成為癌癥的新標(biāo)志，近來亦被認(rèn)為是EMT重要的調(diào)節(jié)者[9]。在未受到刺激的正常細(xì)胞中，NF-κB亞基與I-κBα、β或γ結(jié)合，以非活性形式被阻滯在胞漿中，當(dāng)受到TNF-α等炎癥因子刺激后，激活I(lǐng)-κB激酶(IKK)復(fù)合物，使IKKβ磷酸化形成p-IKKβ，后者將NF-κB p65/p52二聚體中的p65的Ser536亞基磷酸化(即p-p65)，進(jìn)而啟動核轉(zhuǎn)錄程序，p-p65進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用，如促進(jìn)炎癥擴(kuò)散、對抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，此為NF-κB信號通路的經(jīng)典激活途徑[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中p-p65的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，且其表達(dá)水平與TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明NF-κB信號通路在胃癌中異?；罨?，并影響其侵襲轉(zhuǎn)移過程。

H.pylori通常定植于人胃黏膜，它的長期定植引起從慢性胃炎、胃萎縮、腸化生、不典型增生到最終胃癌發(fā)生的胃部疾病的漸變，被認(rèn)為是胃癌發(fā)生的高危因素[11-12]。Martel等[13]報道，約有75%～90%的非賁門胃腺癌發(fā)病與幽門螺桿菌的感染有關(guān)。本研究顯示，胃癌組織中H.pylori感染率明顯高于癌旁正常組織，且在胃癌組織中H.pylori感染與TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)胃癌發(fā)生與H.pylori感染密切相關(guān)。徐世琴等[14]發(fā)現(xiàn)，H.pylori感染可導(dǎo)致胃炎患者胃黏膜中核因子NF-кB表達(dá)水平升高，隨著患者病情的不斷進(jìn)展NF-кB表達(dá)水平也呈現(xiàn)出升高趨勢。許多研究表明，H.pylori合成分泌的毒力因子CagA可以引起PI3K和Akt的持續(xù)激活，從而導(dǎo)致NF-κB信號通路的活化和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的變化[15]；此外，CagA與TNF受體相關(guān)因子6(TRAF6)和TGF-β活化激酶1(TAK1)相互作用以激活TAK1，TAK1磷酸化并激活I(lǐng)KKβ形成p-IKKβ，最終激活NF-κB信號通路[16]。NF-κB信號通路活化后可啟動Slug、Twist家族bHLH轉(zhuǎn)錄因子1(TWIST1)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子(SNAIL)的轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[17]?？傊?，H.pylori感染細(xì)胞可以激活NF-κB信號通路，在誘導(dǎo)炎癌轉(zhuǎn)變以及胃癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用[18-19]。本研究表明，胃癌組織中H.pylori感染與p-p65的陽性表達(dá)呈顯著正相關(guān)，提示胃癌中H.pylori感染與NF-κB信號通路的活化之間關(guān)系密切。同時，胃癌組織中H.pylori感染和p-p65的表達(dá)均與Vimentin的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，與E-cadherin的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，提示胃癌中H.pylori感染和NF-κB信號通路的活化與EMT的發(fā)生密切相關(guān)。此外，H.pylori感染與p-p65表達(dá)陽性的胃癌患者表現(xiàn)出更差的預(yù)后和更低的生存率，多因素分析提示H.pylori感染是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素?；谖墨I(xiàn)報道及結(jié)合本研究結(jié)果，我們推測H.pylori感染可能導(dǎo)致NF-κB信號通路的異?；罨T導(dǎo)EMT發(fā)生，從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響患者預(yù)后。但本研究結(jié)果表明p-p65的高表達(dá)并不能作為胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險因素，原因可能為EMT的發(fā)生還涉及TGF-β、Wnt、Hedgehog、Notch、FAK等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[20]，NF-κB信號通路可能與上述通路交互作用共同影響胃癌中EMT的進(jìn)程，具體還需要進(jìn)一步的研究和探討。

綜上所述，H.pylori感染與NF-κB信號通路的活化及EMT的發(fā)生密切相關(guān)，在胃癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。檢測H.pylori感染、p-p65、Vimentin和E-cadherin的表達(dá)有助于胃癌患者臨床特征及預(yù)后的判斷，而H.pylori感染影響NF-κB信號通路激活與EMT發(fā)生的具體分子機(jī)制是我們后續(xù)研究重點(diǎn)。