孫曉梅，于 鴿，魯慧文，朱生巍，陳紅興，黃 濤＊，高若男，和軍飛，孫義姍，謝 蘇

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000）

人們于20世紀(jì)中期，觀察到家畜的脊椎數(shù)目有發(fā)生變異的現(xiàn)象。至今發(fā)現(xiàn)具有多脊椎性狀的家畜包括豬、羊和牛[1]。野豬及中國大部分地方豬種的脊椎總數(shù)為一般為19～20根；西方商業(yè)豬種對(duì)于脊椎數(shù)相關(guān)的體長、胴體長等性狀進(jìn)行了高強(qiáng)度的人工選擇，使得西方商業(yè)豬種脊椎總數(shù)達(dá)到21～23根，其中胸椎數(shù)為14～16根，腰椎為5～7根[2-3]。

遺傳因素是影響豬脊椎數(shù)目的主導(dǎo)原因，并且多脊椎性狀是遺傳力[4]（0.6～0.74）很高的重要經(jīng)濟(jì)性狀，因?yàn)樗c豬的體型、胴體長度和產(chǎn)肉量有關(guān)。脊椎數(shù)偏多的個(gè)體相對(duì)一般個(gè)體體型長、產(chǎn)肉性能高；據(jù)估計(jì)，多一根脊椎骨可以使胴體長度增加約為40 mm，體重增加約4～8 kg[5]。

脊椎動(dòng)物的脊椎骨形成于胚胎發(fā)育早期，其形成過程復(fù)雜，受多個(gè)基因的調(diào)控，具體調(diào)控機(jī)制還未明確，因此諸多候選基因需要不斷地去探索和發(fā)現(xiàn)。目前，遺傳研究表明[4]調(diào)控豬肋骨數(shù)變異的關(guān)鍵因素是VRTN基因的遺傳多態(tài)性，研究商品豬的VRTN基因與肋骨數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)性及不同品種豬的VRTN基因遺傳效應(yīng)，可為豬產(chǎn)肉性能的提高提供重要的分子依據(jù)和理論基礎(chǔ)，具有重要的實(shí)踐意義[6]。通過選育胸腰椎數(shù)較多的專門化培育品系，在生豬養(yǎng)殖上具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和意義。

Nakano等[7]研究表明，VRTN基因可作為一種有效的選擇標(biāo)記，用于獲得具有高胸椎數(shù)和長度相關(guān)性狀的豬，而不會(huì)對(duì)肉類生產(chǎn)性狀產(chǎn)生不利影響。閆德超[8]通過對(duì)718頭法系和324頭美系大白豬VRTN基因ins291位點(diǎn)進(jìn)行研究，確定VRTN基因是影響豬脊椎數(shù)變異的基因，同時(shí)也是使豬只體長和乳頭數(shù)增加以及提高生長速率的有利等位基因。

我國養(yǎng)豬界習(xí)慣把從某國引入的種豬稱為某系種豬，例如美系、加系、丹系、法系等。本研究以天康畜牧有限公司商品豬和8個(gè)不同品系的種公豬為研究對(duì)象，通過檢測VRTN基因多態(tài)性，驗(yàn)證VRTN基因在天康豬群中的遺傳效應(yīng)，比較不同來源種豬的多脊椎基因頻率，以期為天康種豬的選育提供理論依據(jù)，加快多肋基因的品系及品種選育，提高豬的產(chǎn)肉性能以及養(yǎng)殖效益。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品的采集及表型測定

本實(shí)驗(yàn)所需的283頭種公豬和230頭商品豬來自新疆天康畜牧公司，種公豬和商品豬分別采用相同的生產(chǎn)流程和營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。

商品豬樣品采集及表型測定：試驗(yàn)所需的商品豬樣品均來自新疆天康食品公司屠宰場，對(duì)230份商品豬胴體數(shù)清肋骨數(shù)，采集肌肉樣品提取DNA。

種公豬樣品采集：選擇體況良好的283頭存欄種公豬采集耳組織樣品提取DNA，記錄個(gè)體和品種信息。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑見表1。

表1主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

表1 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA 的提取

取豬組織樣品各0.1 g在1.5 mL EP離心管中，在保證無相互污染的情況下，用手術(shù)剪將樣品充分剪碎。按照TIANGEN公司組織基因組DNA提取試劑盒說明書，提取實(shí)驗(yàn)豬耳組織和肌肉組織樣品基因組DNA?；蚪MDNA提取后，利用 NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)檢測DNA 的純度和濃度，稀釋至100 ng/μL左右用于PC擴(kuò)增，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR 擴(kuò)增

依據(jù)文獻(xiàn)[9]中研究的影響豬肋骨數(shù)性狀的V R T N 基因g.20311_20312 ins291位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物。用2%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離，依據(jù)條帶大小對(duì)商品豬和種公豬不同個(gè)體VRTN基因ins291位點(diǎn)進(jìn)行分型判定。

引物由新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見表2，PCR 反應(yīng)體系：2×Taq MasterMix（7.5 μL）、ddH2O（6.2 μL）、PCR上、下游引物（10 μM，0.4 μL）及DNA 模板（100 ng/μL，0.5 μL）混合總體積為15 μL。PCR 反應(yīng)程序：預(yù)變性（95 ℃，5 min）、變性（95 ℃，30 s）、 退 火（60 ℃，30 s）、 延伸（72 ℃，30 s）、終延伸（72 ℃，5 min）、保存（-4 ℃，60 min）。

1.2.3 基因多態(tài)性檢測

對(duì)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，置于凝膠電泳成像分析系統(tǒng)中拍照?；蛐蜋z測VRTN基因影響胸椎數(shù)是通過一段291 bp的序列插入造成，瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物呈現(xiàn)出多態(tài)性。

表2 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

用EXCEL對(duì)基因頻率和基因型頻率進(jìn)行原始數(shù)據(jù)整理，同時(shí)計(jì)算群體遺傳多態(tài)性參數(shù),包括多態(tài)信息含量（PIC）、有效等位基因數(shù)（Ne）、遺傳雜合度（He）。并使用Hardy—Weinberg平衡性檢驗(yàn)。

運(yùn)用IBM SPSS Statistics 19軟件的一般線性模型（General Linear Model）對(duì)基因型效應(yīng)進(jìn)行分析，將不同基因型作為標(biāo)記效應(yīng)，從而建立固定模型對(duì)不同基因型之間的肋骨對(duì)數(shù)（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）進(jìn)行F檢驗(yàn)和多重比較?；蛐托?yīng)與肋骨對(duì)數(shù)相關(guān)分析模型：

Yij＝ u＋Markeri＋eij

其中：Yij 為群體中個(gè)體的肋骨數(shù)表型記錄值，u為群體的肋骨數(shù)表型平均值，Markeri為候選基因的基因型的標(biāo)記效應(yīng)，eij為隨機(jī)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 VRTN 基因PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果及基因判型

圖1 VRTN 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測及基因型判斷結(jié)果

用2% 的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)VRTN 基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)插入突變?yōu)?11 bp目的片段的基因型為QQ型，僅含有120 bp的目的片段的基因型為qq型，分型為兩條帶既有411 bp又含有120 bp片段的基因型為Qq型。經(jīng)檢測后可知，在商品豬和種公豬群體中 VRTN 基因目的片段的3種基因型均存在。

2.2 VRTN 基因多態(tài)性對(duì)商品豬肋骨對(duì)數(shù)的影響

在天康杜長大三元雜交商品豬群體中，個(gè)體肋骨對(duì)數(shù)呈現(xiàn) QQ型＞Qq型＞qq型的趨勢(shì)，且VRTN基因ins291位點(diǎn)處為QQ型個(gè)體的平均肋骨對(duì)數(shù)比qq型個(gè)體平均肋骨對(duì)數(shù)多1.23對(duì)，如表3所示，QQ型個(gè)體的肋骨對(duì)數(shù)極顯著高于Qq型個(gè)體的肋骨對(duì)數(shù)（P ＜0.01），極顯著高于qq型個(gè)體的肋骨對(duì)數(shù)（P＜0.01）；Qq個(gè)體的肋骨對(duì)數(shù)極顯著高于qq型的肋骨對(duì)數(shù)（P＜0.01）。

由商品豬肋骨對(duì)數(shù)與基因型數(shù)量關(guān)系可知（如表4），14對(duì)肋骨數(shù)的商品豬共有92頭，qq基因型數(shù)量最多，占59.8%；15對(duì)肋骨數(shù)的商品豬共有103頭，基因型數(shù)量最多的是Qq型，占61.2%；而在16對(duì)肋骨數(shù)的35頭商品豬中，不存在qq基因型，QQ型數(shù)量最多，占77.1%，說明肋骨對(duì)數(shù)與VRTN基因ins291位點(diǎn)處的插入突變相關(guān)?？梢酝茢郪RTN基因ins291位點(diǎn)因?yàn)榇嬖诓迦胪蛔儯≦Q基因型），所以會(huì)使肋骨對(duì)數(shù)有增加的趨勢(shì)，則Q為肋骨對(duì)數(shù)變異的有利等位基因。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，商品豬群體的χ2＜χ20.05（2）=5.99，表明該群體處于Hardy—Weinberg平衡狀態(tài)。

2.3 不同品種種豬VRTN 基因型分布

長白種豬中，A系長白QQ為優(yōu)勢(shì)基因型（如表5所示），而B系長白的優(yōu)勢(shì)基因型Qq（0.49）。等位基因Q基因頻率為A系長白＞B系長白。因?yàn)镼為有利突變基因，且長白豬一般作為二元母豬的父系，故可選擇A系長白作為種豬對(duì)后代進(jìn)行育種改良，可以增加后代群體中的多肋基因頻率。

大白種豬中，A系大白、B系大白的優(yōu)勢(shì)基因型分別為qq（0.60）和Qq（0.58）（如表5所示），等位基因Q基因頻率為A系大白＞B系大白。兩個(gè)品系大白豬有利基因Q頻率都大于0.5，在后期選擇可以選A系大白作為二元母豬母本。

杜洛克種豬有4個(gè)不同品系，除B系杜洛克以Qq（0.58）為優(yōu)勢(shì)基因型（如表5所示），AC系杜洛克、BC系杜洛克及C系杜洛克都是以QQ為優(yōu)勢(shì)基因型。有利等位基因Q頻率為：BC系杜洛克＞C系杜洛克＞AC系杜洛克＞B系杜洛克。可見BC系杜洛克作為終端父本種畜具有較大的優(yōu)勢(shì)。

3 討論

VRTN是一種蛋白編碼基因，具有特異性DNA序列結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)座酶活性。在人的不同組織或細(xì)胞中，VRTN基因的表達(dá)量不同，但差異不顯著；在小鼠的巨紅細(xì)胞祖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞系V26-2-P16和胰腺中高量表達(dá)，但在其他組織或細(xì)胞中基因的表達(dá)豐度幾乎無差別，均較低。對(duì)斑馬魚的研究表明，VRTN基因是一個(gè)核內(nèi)定位的轉(zhuǎn)錄抑制因子，是一種新的在斑馬魚卵細(xì)胞植物極定位的母源因子，VRTN與bmp2b調(diào)控序列結(jié)合，并作為阻遏物抑制其合子轉(zhuǎn)錄。在受精后迅速地向動(dòng)物極移動(dòng)，獨(dú)立調(diào)節(jié)bmp2b基因在背腹軸的表達(dá)，確保bmp2基因在背腹軸正常的濃度梯度，從而使胚胎背腹軸發(fā)育正常[10]。

表3 VRTN 基因ins291 處多態(tài)性與商品豬肋骨數(shù)關(guān)聯(lián)分析

表4 商品豬肋骨數(shù)與基因型數(shù)量關(guān)系

表5 不同豬品種VRTN 基因型頻率及等位基因頻率分布

范寅等[11]對(duì)來自白色杜洛克與二花臉雜交F2代、蘇太豬、二花臉與通城豬雜交這三個(gè)群體進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)VRTN基因的g.20311_20312ins291位點(diǎn)與肋骨對(duì)數(shù)表型關(guān)聯(lián)極顯著。張慧[12]通過對(duì)609頭杜長大三元雜交豬進(jìn)行試驗(yàn)，確定g.19034A＞C及g.20311_20312ins291是功能性突變位點(diǎn)，符合因果突變的特性，并且這兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)VRTN的表達(dá)具有加性遺傳效應(yīng)。吳一塵等[13]對(duì)蘇淮豬VRTN基因ins 291位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析，研究表明蘇淮豬群體存在高脊椎數(shù)等位基因。陳偉等[14]對(duì)大白豬群體進(jìn)行研究，從而推斷VRTN基因中SINE插入多態(tài)也許與豬瘦肉率和生長速度有關(guān)聯(lián)，可能會(huì)使豬生長速度和眼肌面積降低，并不影響產(chǎn)仔數(shù)?？梢奦RTN基因ins291位點(diǎn)突變會(huì)使豬肋骨對(duì)數(shù)產(chǎn)生增加效應(yīng)，具有加性遺傳效應(yīng)。

李娜等[15]研究松遼黑豬VRTN基因多態(tài)性與肋骨對(duì)數(shù)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)112 bp突變位點(diǎn)插入一個(gè)約289 bp突變與肋骨對(duì)數(shù)變異具有關(guān)聯(lián)。沈瑞玲等[16]研究棗莊黑蓋豬群體中VRTN基因ins291突變位點(diǎn)缺失型為優(yōu)勢(shì)基因型。歐陽子璇[17]研究表明SSC7上的VRTN基因NV123 ins 291位點(diǎn)對(duì)杜長大三元雜交豬的胸椎數(shù)影響極顯著。張文克[18]通過對(duì)松遼黑豬和杜長大三元雜交豬進(jìn)行肋骨對(duì)數(shù)表型值相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)VRTN基因112 bp位點(diǎn)插入的突變與肋骨對(duì)數(shù)表型變異存在關(guān)聯(lián)性。這與本研究的VRTN基因ins291 bp位點(diǎn)處極顯著影響商品豬杜長大三元雜交豬群體個(gè)體肋骨對(duì)數(shù)（P＜0.01），并且呈現(xiàn)QQ型＞Qq型＞qq型趨勢(shì)，QQ個(gè)體肋骨對(duì)數(shù)比qq型多1.24對(duì)以上，結(jié)果相符。

本研究在不同品系種豬中發(fā)現(xiàn)，長白種豬群中有利等位基因Q基因頻率為A系＞B系；大白種豬群中有利等位基因Q基因頻率為A系＞B系；有利等位基因Q頻率為：杜洛克種豬群中BC系＞C系＞AC＞B系。以QQ為優(yōu)勢(shì)基因的A系長白、A系大白、BC系杜洛克和C系杜洛克種豬可用于生產(chǎn)多肋商品豬。