西南高溫高濕地區(qū)青貯中天然乳酸菌群落結構特征及優(yōu)質乳酸菌的篩選

關 皓，曾泰儒，帥 楊，閆艷紅，張新全

（四川農業(yè)大學動物科技學院，四川 成都 611130）

青貯是保持飼料營養(yǎng)價值最有效的技術之一[1]，其品質取決于青貯自然發(fā)酵過程，即青貯后立即由同型發(fā)酵乳酸菌進行發(fā)酵，從而導致飼料酸化，抑制有害微生物生長[2]。然而，在熱帶和亞熱帶地區(qū)難以生產出高品質的青貯飼料[3-4]。這些地區(qū)在夏季大規(guī)模青貯生產過程中經常遭受高溫和大量降水等不利天氣條件，嚴重影響青貯發(fā)酵和有氧穩(wěn)定性[5]。青貯原料附生乳酸菌在生產優(yōu)質青貯飼料中發(fā)揮著重要作用。然而，乳酸菌并不是植物上唯一的微生物，梭狀芽孢桿菌、腸桿菌、酵母和霉菌也常生長于植物上，并與乳酸菌競爭水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate, WSC)。此外，植物上附著的天然乳酸菌種群因植物而異，數量從(1 × 102)～(1 × 109) cfu·g-1鮮樣(fresh matter,FM)不等[6]。環(huán)境條件也會影響植物上附著的乳酸菌數量。而乳酸菌數量和活性是抑制不良微生物生長和減少發(fā)酵損失的一個重要因素，自然發(fā)酵品質取決于青貯材料上初始乳酸菌數量和底物的含量。Pahlow 等[6]報道，在溫暖地區(qū)生長的青貯原料上附著的乳酸菌數量和種類比在寒冷地區(qū)的更多、更豐富。因此，了解濕熱地區(qū)青貯原料上附著的天然乳酸菌組成是調制優(yōu)質青貯飼料的前提。

當青貯發(fā)酵受環(huán)境影響時，乳酸菌常被作為青貯飼料添加劑，用于提高青貯發(fā)酵品質[7]。然而，并非所有的乳酸菌接種劑都能在大多條件下獲得良好的發(fā)酵效果，尤其是在高溫高濕的環(huán)境中。在青貯初期，當空氣仍然存在于植物間隙時，由于植物呼吸和好氧微生物的持續(xù)活動，溫度可能會上升到40 ℃以上[3]。青貯飼料在夏季可能會長時間受高溫的影響，特別是在熱帶和亞熱帶地區(qū)。Chen 等[8]報道了一種商業(yè)乳酸菌接種劑LP(Lactobacillus plantarum和Pediococcus acidilactici混合)不能適應較高溫度下(45 ℃)的青貯環(huán)境。此外，研究表明，商業(yè)乳酸菌接種劑(L. plantarumMTD-1)對高溫青貯(50 ℃)沒有任何幫助，而分離的兩株菌株(P. acidilacticiGG13 和L. rhamnosusGG26)通過降低pH、丁酸、銨態(tài)氮(NH3-N)和乳酸含量提高了象草(Pennisetum purpureum)高溫青貯質量[9]。這些研究表明，由于商業(yè)乳酸菌的篩選與使用多在溫帶地區(qū)，高溫會在一定程度上影響其使用效果，在當地條件下篩選的乳酸菌菌株則有更佳的適應性。

綜上，了解濕熱地區(qū)的青貯原料上乳酸菌種群是提高該地區(qū)青貯的前提，篩選適宜當地條件的優(yōu)質乳酸菌是提高該地區(qū)青貯飼料發(fā)酵質量的關鍵。因此，本研究的目的是調查高溫高濕地區(qū)乳酸菌組成，篩選適宜的當地乳酸菌菌株，探明耐高溫乳酸菌的生物學特性及發(fā)酵特性，為后續(xù)的乳酸菌添加劑的研究提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 樣品采集和菌株分離

樣品為3 個品種的玉米(Zea mays) (雅玉8 號、中單808 號和多玉3 號)和桂牧一號雜交象草[(P.purpureum‘Mott’) × (P. americanum×P. purureum)]‘Guimu No. 1’及其分別制成的青貯飼料，均來自中國西南高溫高濕地區(qū)(表1)，玉米原料為乳熟期的全株玉米，雜交象草在高度大于1.5 m 時收獲。全株玉米青貯樣品在大窖中發(fā)酵兩個月后取樣，雜交象草青貯樣品則在裹包青貯3 個月后取樣。

原料和青貯樣品均稱取20 g 于180 mL 無菌蒸餾水中在4 ℃下震蕩1 h，再在無菌蒸餾水中連續(xù)稀釋1 × 10-1至1 × 10-10。在MRS 培養(yǎng)基(陸橋科技有限公司，北京，中國)中37 ℃培養(yǎng)48 h 后對乳酸菌進行分離，為了確保真實地反映原料和青貯中乳酸菌群落結構，從每種樣品MRS 培養(yǎng)基中隨機抽取20～40 株菌株，共收集251 株菌[10]。通過革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗確定其中227 株為乳酸菌[11]。將227 株乳酸菌放入加有甘油的保藏管中-20 ℃保存。

表 1 青貯前后樣品信息及227 株乳酸菌鑒定結果、分布詳情Table 1 Sample information before and after ensiling and identification and distribution of 227 strains of lactic acid bacteria

1.2 227 株乳酸菌基因組的提取

將227 株乳酸菌置于37 ℃中過夜培養(yǎng)，10 000 r·min-1離心5 min，用TE 緩沖液在15 mL 離心管中洗滌兩次后再離心。DNA 提取采用TIANamp細菌DNA 試劑盒(DP302-02，天根科技有限公司，北京，中國)[12]。DNA 使用前保存在 -20 ℃。

1.3 227 株乳酸菌16S rRNA 基因序列鑒定

對227 株乳酸菌16S rRNA 序列進行PCR 擴增。1 μL DNA 作為模板，PCR 引物為27f (5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′)和1492r (5′-TACGGCTACCTTG TTACGACT-3′)[11]，反應體系為20 μL 體系。PCR 程序：95 ℃下處理5 min；94 ℃變性30 s，在55 ℃下退火1 min，循環(huán)30 次；72 ℃延伸15 min，最后72 ℃保溫10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳在1 ×TBE 緩沖液中檢測PCR 產物質量，合格的PCR 產物送上海生工公司進行序列分析[11]。利用BLAST分析方法，將測得的16S rDNA序列與GenBank 的16S rRNA 序列進行比對，相似度高于99%的序列被認為是同一株菌[11]。

1.4 乳酸菌的篩選及生理生化特性測定

分離到的227 株乳酸菌首先放置于MRS 液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，在12 和24 h 時測其OD600nm及pH，篩選出生長效率最高、產酸能力最強的30 株菌。再將初篩出的30 株菌放置于MRS 培養(yǎng)基中45 ℃培養(yǎng)，在12 和24 h 測其OD 及pH，篩選出生長效率最高、產酸能力最強的4 株乳酸菌(LP149、 LS358、 LR753 和LPA761)[13]。 根 據Cai等[12]描述的乳酸菌鑒定方法，對這4 株菌進行革蘭氏染色、菌落形態(tài)、過氧化氫酶活性和葡萄糖產氣試驗。糖發(fā)酵試驗采用試劑盒方法(陸橋科技有限公司，北京，中國)。

1.5 篩選到的4 株乳酸菌系統發(fā)育樹的構建

利用BLAST 分析方法，將16S rDNA 序列與GenBank 的16S rRNA 序列進行比對，通過鄰接法構建系統發(fā)育樹[14]。使用CLUSTALW 軟件對1 000 個隨機重采樣的序列數據進行bootstrap 分析，評估系統發(fā)育樹的拓撲結構[15]。以枯草芽孢桿菌NCDO1769為外圍菌株[11]。本研究中4 株乳酸菌16S rRNA 基因序列已被GenBank 收錄，序列號：MH337263 為LP149，MH333261 為LS358，MH333262 為LR753，MH333263 為LPA761。

1.6 篩選到的4 株乳酸菌耐溫、耐酸及耐鹽測定

耐溫試驗：將篩出的4 株菌(LP，ATCC 14917；LS，ATCC 11741；LR，ATCC 7469；LPA，ATCC 334)、標準菌及商業(yè)乳酸菌(LPC，四川高福記生物科技公司)接入MRS 液體培養(yǎng)基中，分別置于4、10、20、30、40、45、50 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 d 后測定各組發(fā)酵液的OD600nm，每個處理重復3 次[11]。

耐酸試驗：用經過無菌處理的HCl 溶液和NaOH 溶液調整MRS 液體培養(yǎng)基pH，將上述菌株接入pH 為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 的MRS 液體培養(yǎng)基中[11]，分為兩組，分別在37 和45 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，測定培養(yǎng)基OD600nm。

耐鹽試驗：將上述活化的乳酸菌接入NaCl溶液體積分數為3.0%和6.5%的MRS 液體培養(yǎng)基中[11]，分為兩組，分別在37 和45 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，于600 nm 處 測 定 培 養(yǎng) 基OD 值。OD 值 ＜0.05 代表不生長(-)，OD 值在0.05～0.1 表示微弱生長(W)，OD 值在0.1～0.5 表示生長(+)，OD 值 ＞0.5 代表生長良好(++)。

1.7 篩選到的4 株乳酸菌在不同溫度條件下生長曲線測定

將活化好的菌和所對應的標準菌株(LP，ATCC 14917；LS，ATCC 11741；LR，ATCC 7469；LPA，ATCC 334)及一株商業(yè)植物乳桿菌(LPC，四川高福記生物科技公司)接種到MRS 液體培養(yǎng)基中，每組設置3 個重復，分別置于37 與45 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。每隔2 h 取一次液體發(fā)酵液樣品，連續(xù)測定48 h，以空白的MRS 培養(yǎng)基為對照，在600 nm下測定樣品的OD 值，以培養(yǎng)時間為橫坐標，相對應的吸光值為縱坐標，繪制乳酸菌生長曲線。

1.8 篩選到的4 株乳酸菌在不同溫度條件下的產酸曲線

將活化好的上述乳酸菌接種入MRS 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)方法同上，每組設置3 個重復，分別置于37 和45 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，每隔2 h 采用pH計測定各菌株發(fā)酵液pH，連續(xù)測定48 h，以空白的MRS 培養(yǎng)基為對照，以培養(yǎng)時間為橫坐標，pH為縱坐標，繪制乳酸菌產酸速率曲線[13]。

1.9 數據分析

采用SPSS 統計軟件包的單因素方差分析法(ANOVA)，對生長曲線和產酸曲線進行分析。采用Turkey 顯著性差異(HSD)檢驗對不同的樣本均值進行檢驗，P＜0.05 為顯著。

2 結果

2.1 西南濕熱地區(qū)自然乳酸菌群落結構

通過16S rRNA 測序和序列分析比較(表1)，227 株乳酸菌菌株分屬乳酸桿菌屬、片球菌屬(Pediococcus)和魏斯氏菌屬(Weissella) (圖1)，其中包含了8 個種的乳酸菌：植物乳桿菌(L. plantarum)142 株，鼠李糖乳桿菌(L. rhamnosus)30 株，副干酪乳桿菌(L. paracasei) 21 株，分別占乳酸菌總數的62.55%，13.21%，9.25%；戊糖片球菌(P. pentosaceus)10 株，占4.40%；乳酸菌片球菌(P. acidilactici)8 株，占3.52%；L. farraginis9 株，占3.96%；食竇魏斯氏菌(Weissella cibaria) 3 株，占1.32%；唾液乳桿菌(L. salivarius)和W. paramesenteroides各2 株，均占0.88%。

2.2 分離的乳酸菌菌株生理生化特性及鑒定

測定了篩選到的4 株乳酸菌和4 株標準菌及1 株商用植物乳桿菌LPC 的生理生化特性(表2)。分離菌株均為革蘭氏陽性和過氧化氫酶陰性，均呈桿狀。LP149 和LPC 均無法消耗葡萄糖產生氣體，可以產生DL-乳酸，表明它們是同型發(fā)酵乳酸菌，其余3 株菌為異型發(fā)酵乳酸菌。

與標準菌株相比，LP149 不能利用菊粉、山梨醇、D-甘露醇、水楊苷和半固體瓊脂，對苦杏仁苷的利用較弱，能較好利用鼠李糖、木糖以及馬尿酸(表3)；而LS358 對菊粉、阿拉伯糖、馬尿酸的利用能力較強，對水楊苷的利用較弱，不能利用山梨醇、D-甘露醇、鼠李糖、七葉苷和半固體瓊脂；LR753 對蜜二糖和木糖的利用能力良好，但相對于標準菌株，對菊粉的利用能力下降，對鼠李糖的利用能力有所提；LPA761 不能利用菊粉和苦杏仁苷，對鼠李糖利用能力較強，對棉子糖和乳糖的利用能力減弱。系統發(fā)育樹結果表明，LP149、LS358、LR753 及LPA761 與L. plantarum、L. salivarius、L. rhamnosus和L. paracasei標 準 菌 序列相似度均為100% (圖2)。

圖 1 西南高溫高濕地區(qū)玉米和狼尾草青貯前后乳酸菌種群結構Figure 1 Community of lactic acid bacteria in corn and Pennisetum before and after ensiling in hot and humid areas of Southwest China

表 2 乳酸菌的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria

表 3 乳酸菌糖發(fā)酵特性Table 3 Characteristics of sugar fermentation of lactic acid bacteria

圖 2 篩選出的乳酸菌系統發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria

2.3 乳酸菌耐溫、耐酸及耐鹽特性測定

與標準菌株相比，LS358、LR753 和LPA761在45 °C 培養(yǎng)條件下生長良好（表4），表明其耐高溫性較好。與37 °C 相比，45 °C 培養(yǎng)下的乳酸菌表現出不同的耐性特征（表5、表6）。在45 °C 條件下，篩選出的4 株乳酸菌均能在pH 4.5～7 的液體培養(yǎng)基良好生長。在NaCl 濃度為3%的液體培養(yǎng)基中，LPA761 生長較弱，LP149、LS358 和LR753生長狀況良好，在pH7.5 的液體培養(yǎng)基中LP149 和LR753 生長能力較差，LS358 和LPA761 生長能力強。4 株乳酸菌均不能在NaCl 濃度為6.5%和pH 3～4 的液體培養(yǎng)基中生長。

表 4 乳酸菌耐溫性特征Table 4 Temperature tolerance of lactic acid bacteria

表 5 37 ℃下乳酸菌耐鹽性和耐酸性特征Table 5 Salt and acid tolerance of lactic acid bacteria at 37 ℃

表 6 在45 ℃下乳酸菌耐鹽性和耐酸性特征Table 6 Salt and acid tolerance of lactic acid bacteria at 45 ℃

2.4 乳酸菌菌株生長曲線測定

與標準菌株相比較，4 株乳酸菌菌株的生長曲線在37 和45 ℃有著不同的表現(圖3)。在37 ℃時，除LP149 外，3 株自選乳酸菌從培養(yǎng)10 h 開始生長速度達到最大，大概20 h 后生長進入穩(wěn)定期，菌株LP149 未表現出明顯的對數期和穩(wěn)定期，在14 h 時生長速率最快，在22 h 到28 h 時OD 值急劇下降。菌株LP149、LS358、LR753 和LPA761 發(fā)酵20 h 的OD 值分別為1.798、0.904、1.438 和1.373 。綜上，24 h 內LR753 的生長速度最快且較穩(wěn)定，LPA761 生長速度較快，LS358 的生長速度最慢。

在45 ℃時，與標準菌株相比(圖3)，4 株自選菌株的生長情況均更加良好。LP149 在12 h 時OD 值達到最大，從16 h 開始進入穩(wěn)定時期；LS358在8 h 時生長速率最大，從10 h 開始OD 值較穩(wěn)定上升；LR753 在12 h 時生長最快，從16 h 開始進入較穩(wěn)定的時期；LPA761 在8 h 時生長速率達到最大，從10 h 開始進入穩(wěn)定期。

圖 3 乳酸菌生長曲線Figure 3 Growth curves of lactic acid bacteria

2.5 乳酸菌菌株產酸能力對比

在37 和45 ℃下，所有菌株的pH 均從5.5 開始總體呈下降的趨勢，在4.3 左右達到穩(wěn)定(圖4)。37 ℃時，LP149 的pH 波動較大；LS358 和LR753在14 h 時產酸速率最大，在20 h 左右進入穩(wěn)定期；LPA761 在10 h 時pH 下降最快，在20 h 時進入穩(wěn)定時期。

45 ℃時(圖4)，LP149、LS358、LR753 和LPA761在8 h 左右產酸速率達到最大，10 h 左右進入穩(wěn)定時期。而標準菌株和商業(yè)菌株則花費了更多的時間才使得pH 下降，且在48 h 時pH 高于自選菌株。

3 討論

圖 4 乳酸菌產酸曲線Figure 4 Acid production curves of lactic acid bacteria

根據先前使用高通量測序技術[12]對與本研究同一樣品的微生物群落結構的研究發(fā)現，高溫高濕地區(qū)青貯原料附生細菌群落主要是魏斯氏菌屬、假單胞菌屬(Pseudomonas)、乳酸桿菌屬和明串珠菌屬(Leuconostoc)。然而，用這種方法無法獲得乳酸菌種水平上的重要信息。傳統的形態(tài)學、生理生化特征鑒定和單株菌16S rRNA 基因序列分析是彌補高通量測序精度不足的有效手段。本研究發(fā)現，植物乳桿菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌為青貯原料上附著乳酸菌優(yōu)勢種。同型發(fā)酵的片球菌屬細菌是青貯中啟動菌，在發(fā)酵初期便能快速產酸，為乳酸桿菌的生長創(chuàng)造一個適宜的厭氧環(huán)境[2]。此外，Li 和Nishino[16]報道了在玉米青貯飼料中使用梯度凝膠電泳(DGGE)檢測到W.paramesenteroides存在。之前的研究表明[12]，青貯后乳酸桿菌是主要的微生物屬，相對豐度超過50%，其次是醋酸菌和魏氏菌。但具體是哪些種類的乳酸桿菌還不得而知。本研究通過對227 株分離到的乳酸菌進行鑒定發(fā)現，鼠李糖乳桿菌是四川宣漢地區(qū)玉米青貯的優(yōu)勢種，副干酪乳桿菌和植物乳桿菌是四川崇州地區(qū)、重慶云陽地區(qū)和貴州黔西南地區(qū)全株玉米青貯中最豐富的種。通常，植物乳桿菌和副干酪乳桿菌是世界范圍內不同地區(qū)不同青貯類型中常見乳酸菌[7]。盡管鼠李糖乳桿菌被報道作為青貯飼料接種劑[15-18]，但在自然發(fā)酵青貯飼料中并未廣泛發(fā)現。

乳酸菌的特性和儲存溫度對發(fā)酵質量有很大影響[19]。在發(fā)酵的初始階段，當青貯窖中仍存在空氣時，青貯飼料的溫度可能會超過40 ℃，這是由于持續(xù)的植物呼吸和有氧微生物的活動，尤其是在熱帶和亞熱帶地區(qū)[3]。由于在高溫條件下，普通菌株不能很好地生長[8-9]，因此建議使用耐熱乳酸菌加強高溫地區(qū)的青貯飼料發(fā)酵[20]。在本研究中，篩選出的菌株LP149、LS358、LR753 和LPA761 在45 ℃和最低初始pH 3.5 下都能生長。然而，LPC 僅在初始pH 為3.5 時輕微生長，在45 ℃時不能生長。因此，從高溫高濕地區(qū)采集的青貯中篩選的菌株LP149、LS358、LR753 和LPA761 有更好的高溫適應性。

產酸速率和生長速率是評定乳酸菌活性與是否優(yōu)良的重要指標，不同菌株間具有一定程度的差異[19]。微生物的生長曲線一般分為4 個階段：遲緩期、對數期、穩(wěn)定期和衰亡期[21]。在本研究中，高溫對乳酸菌生長曲線和產酸曲線有較大影響。與在37 ℃培養(yǎng)下的菌株相比，在45 ℃培養(yǎng)下的LP149、LS358、LR753 和LPA761 都無明顯的遲緩期，比標準菌株和商業(yè)菌株更早地進入對數期和穩(wěn)定期，展示出了優(yōu)良的耐高溫性和產酸效率，值得進一步在高溫青貯中進行驗證。

4 結論

天然植物乳桿菌是高溫高濕地區(qū)玉米和雜交象草原料和青貯料中最常見的乳酸菌菌株，其次是鼠李糖乳桿菌和副干酪乳桿菌。根據生理、生化特征和16S rRNA 測序分析，篩選出的4 株乳酸菌LP149、LS358、LR753 和LPA761 分別被鑒定為植物乳桿菌、唾液乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和副干酪乳桿菌。篩選出的4 株乳酸菌有良好的高溫適應性，不僅生長速度快，產酸能力強，耐鹽性較好，對糖源利用范圍廣，而且對酸性環(huán)境有較好的適應性，特別是唾液乳桿菌和鼠李糖乳桿菌，作為較少被報道的異型發(fā)酵乳酸菌，可以作為后續(xù)進行高溫青貯回填試驗的新型菌株。