童也 王宇翔 徐海棟

【摘 要】目的：利用生物信息學(xué)方法分析半乳糖凝集素-3（gal-3）在骨關(guān)節(jié)炎中的作用機(jī)制。方法：從GEO數(shù)據(jù)庫中下載經(jīng)gal-3處理的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞芯片，尋找芯片表達(dá)譜的差異基因并對其進(jìn)行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析以及疾病富集分析。此外，利用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件構(gòu)建差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，尋找網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的核心基因。結(jié)果：共篩選出474個差異基因，其中包含

246個上調(diào)的基因與228個下調(diào)的基因。GO富集分析結(jié)果表明，差異基因主要富集的生物學(xué)過程有骨髓白細(xì)胞遷移、白細(xì)胞趨化等;主要富集的細(xì)胞組分有細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)等;主要富集的分子功能有細(xì)胞因子活性、趨化因子活性等。KEGG通路富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差異基因主要涉及的通路有腫瘤壞死因子信號通路、白細(xì)胞介素-17信號通路等。疾病富集分析結(jié)果提示，差異基因主要富集的疾病有關(guān)節(jié)病、肺疾病、萊姆關(guān)節(jié)炎等。差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)在Cytoscape軟件共找出10個核心基因。結(jié)論：骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞在gal-3作用下，可能通過上調(diào)白細(xì)胞介素-6等相關(guān)基因的表達(dá)在骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎;半乳糖凝集素-3;生物信息學(xué);GEO數(shù)據(jù)庫

Bioinformatics Analysis of the Role of Galectin-3 in Osteoarthritis

TONG Ye，WANG Yu-xiang，XU Hai-dong

【ABSTRACT】Objective：To analyze the mechanism of Galectin-3（Gal-3）in osteoarthritis by bioinformatics.Methods：Gal-3-treated osteoarthritis chondrocyte microarrays were downloaded from the GEO database，finding out the differential genes of microarray expression profiles to carry out GO function enrichment analysis，KEGG pathway enrichment analysis and disease enrichment analysis.In addition，the interaction network of differential gene proteins was constructed using database STRING and software Cytoscape to find the core genes in the network structure.Results：A total of 474 differential genes were screened，including 246 up-regulated genes and 228 down regulated genes.The results of GO enrichment analysis showed that the main biological processes of differential gene enrichment were bone marrow leukocyte migration and leukocyte chemotaxis;the main cell components were extracellular matrix and protein extracellular matrix;the main molecular functions were cytokine activity and chemokine activity.The results of enrichment analysis for KEGG pathway showed that the main pathways involved in differential genes were tumor necrosis factor signaling pathway and interleukin-17 signaling pathway.The results of disease enrichment analysis indicated that the main diseases of differential gene enrichment were arthropathy，lung disease，Lyme arthritis and so on.Ten core genes were identified?in the interaction network of differentialgene? proteins by the software Cytoscape.Conclusion：Under the effect of Gal-3，osteoarthritis chondrocytes may play an?important role in the development of osteoarthritis by up-regulating the expre-ssions of interleukin-6 and otherrelated genes.

【Keywords】 osteoarthritis;galectin-3;bioinformatics;GEO database

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是最常見的關(guān)節(jié)炎，主要特征為關(guān)節(jié)軟骨退化及關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)功能發(fā)生變化，是導(dǎo)致老年人慢性關(guān)節(jié)疼痛和致殘的主要原因[1-5]。半乳糖凝集素-3（gal-3）是一種半乳糖結(jié)合蛋白，主要依賴碳水化合物的方式參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞因子分泌等多種生物學(xué)過程。

既往研究發(fā)現(xiàn)，在關(guān)節(jié)炎患者中，滑膜組織與軟骨組織中g(shù)al-3的暴露水平升高，gal-3基于其促炎作用在關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6]。也有研究表明，gal-3在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和OA患者的炎性滑膜中都有表達(dá)水平和分泌量的升高。此外，在實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎中，gal-3會加重關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)以及關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞。gal-3的缺失顯著增加了脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降。同時，脂多糖治療明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而沉默gal-3則明顯抑制脂多糖誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，表明gal-3的缺失可保護(hù)軟骨細(xì)胞免受脂多糖誘導(dǎo)的凋亡[7-8]。

雖然目前有大量研究證據(jù)表明，gal-3在OA的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要的角色，然而，其具體的作用機(jī)制與潛在功能仍不明確。因此，本研究選取經(jīng)gal-3處理的OA軟骨細(xì)胞芯片，利用生物信息學(xué)方法分析OA軟骨細(xì)胞的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，探究其分子機(jī)制與潛在的生物學(xué)標(biāo)志物，為今后OA的機(jī)制研究與臨床治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)的獲取 基于NCBI的Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫，下載人OA軟骨細(xì)胞芯片數(shù)據(jù)，芯片數(shù)據(jù)編號為GSE85254。下載的芯片數(shù)據(jù)集中包含經(jīng)過50 g·mL-1的gal-3處理的OA軟骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組樣本與未經(jīng)特殊處理的OA軟骨細(xì)胞對照組樣本，實(shí)驗(yàn)組與對照組共8個樣本。GPL15207為該芯片的平臺文件。

1.2 芯片數(shù)據(jù)處理 原始芯片數(shù)據(jù)讀入R軟件中，利用affyPLM包中的RMA算法對數(shù)據(jù)做背景校正和標(biāo)準(zhǔn)化處理。表達(dá)譜數(shù)據(jù)中存在多個探針對應(yīng)同一個基因的情況，通過取基因表達(dá)平均值的方法合并探針數(shù)據(jù)。在R軟件Immpute包中，選用KNN（K-Nearest Neighbor）算法補(bǔ)充表達(dá)譜數(shù)據(jù)中的缺失值。最后，通過平臺文件GPL16043將探針名注釋為對應(yīng)的基因名。

1.3 篩選差異表達(dá)基因 基于R軟件中Limma包，對實(shí)驗(yàn)組與對照組之間的基因表達(dá)值通過雙尾t檢驗(yàn)計(jì)算P值，同時使用默認(rèn)的BH（Benjamini and Hochberg）方法對P值進(jìn)行校正。設(shè)置差異倍數(shù)|log2 Fold Change| > 1.5且校正后的P值adj.P.Val < 0.05作為差異基因的篩選條件。

1.4 差異基因的富集分析 利用R軟件中的clusterProfiler軟件包[9]，對上述得到的差異基因分別進(jìn)行基因本體論（GO）生物學(xué)功能富集分析、京都基因和基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析以及疾病富集分析。富集分析的過程中，校正后的P值adj.P.Val < 0.05認(rèn)為該富集有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 基于STRING 11.0數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），對差異基因進(jìn)行蛋白-蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，設(shè)置最小有效結(jié)合分?jǐn)?shù)為0.7。分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1（https：//cytoscape.org/）軟件中進(jìn)行可視化。此外，利用Cytoscape 軟件中的cytoHubba插件計(jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中每個節(jié)點(diǎn)的度值（degree），節(jié)點(diǎn)的degree越高則表明該節(jié)點(diǎn)與越多其他的節(jié)點(diǎn)存在相互聯(lián)系，進(jìn)而說明高degree的節(jié)點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中具有重要的樞紐作用。因此，將degree最高的前10個基因視為PPI網(wǎng)絡(luò)中重要的基因，即核心基因（hub genes）。

2 結(jié) 果

2.1 差異基因篩選結(jié)果 預(yù)處理后的數(shù)據(jù)通過R軟件中Limma包篩選實(shí)驗(yàn)組與對照組之間的差異基因，結(jié)果表明，共有474個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)的基因有246個，下調(diào)的基因有228個?；赗軟件中pheatmap包繪制了差異基因表達(dá)量熱圖，見圖1。列出差異基因中變化最為顯著的前10個上調(diào)與下調(diào)的基因，見表1。

2.2 差異基因富集分析結(jié)果 GO富集分析包括生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）。GO富集分析結(jié)果表明，差異基因主要富集的BP有骨髓白細(xì)胞遷移、白細(xì)胞遷移的正調(diào)控、白細(xì)胞趨化、白細(xì)胞趨化的調(diào)控等;主要富集的CC有細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)、膜區(qū)域等;主要富集的MF有細(xì)胞因子活性、趨化因子活性、G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合等，對GO分析結(jié)果中BP、MF與CC的前10項(xiàng)進(jìn)行可視化，見圖2。KEGG通路富集分析結(jié)果則發(fā)現(xiàn)，差異基因主要涉及的通路有腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、IL-17信號通路、核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）信號通路、趨化因子信號通路、Toll樣受體信號通路等，對其結(jié)果進(jìn)行可視化，見圖3。疾病富集分析結(jié)果提示，差異基因主要富集的疾病有關(guān)節(jié)病、肺疾病、萊姆關(guān)節(jié)炎等，對其結(jié)果進(jìn)行可視化，見圖4。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果在Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化，見圖5。利用cytoHubba插件計(jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中節(jié)點(diǎn)的degree，degree前10的核心基因從高到低分別有IL-6、TNF、CXCL10、CXCL8、IL-1β、CXCL1、C3、CCL20、CXCL2、CCL2，見圖6。

3 討 論

慢性炎癥是關(guān)節(jié)軟骨退行性變的主要原因，其中，TNF-α、IL-1β等多種促炎性細(xì)胞因子以及生物力學(xué)因素參與慢性炎癥的發(fā)展。多種致炎因素激活關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞并產(chǎn)生大量一氧化氮，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡、破壞軟骨結(jié)構(gòu)。在OA眾多的發(fā)病機(jī)制中，軟骨細(xì)胞被認(rèn)為是OA的關(guān)鍵調(diào)控因子。先前已有研究表明，軟骨細(xì)胞軟骨變性與gal-3呈正相關(guān)，且gal-3增強(qiáng)了功能性O(shè)A標(biāo)志物的表達(dá)[10]。

本研究選取OA軟骨細(xì)胞芯片數(shù)據(jù)，將gal-3處理的軟骨細(xì)胞樣本作為實(shí)驗(yàn)組，與未處理的對照組軟骨細(xì)胞樣本進(jìn)行比較，通過R軟件共篩選出474個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)的基因有246個，下調(diào)的基因有228個。在上調(diào)的差異基因中，差異最顯著的前5個基因有IL-8、CXCL3、CCL20、CXCL5、CXCL2。這表明，gal-3主要通過炎性因子和趨化因子基因表達(dá)量的上調(diào)，從而加重軟骨組織的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加速關(guān)節(jié)軟骨的破壞與OA疾病的進(jìn)展，同時也提示我們，基因通常是以模塊化或者網(wǎng)絡(luò)化的形式共同發(fā)揮生物學(xué)作用的。先前的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，OA軟骨組織中CCL20蛋白表達(dá)量增加，此外，供體軟骨細(xì)胞中CCL20 mRNA的表達(dá)雖然較低，但在促炎細(xì)胞因子刺激后表達(dá)升

高[11]。筆者發(fā)現(xiàn)的差異基因中CCL20顯著上調(diào)，進(jìn)一步印證了gal-3的促炎作用。

GO富集分析結(jié)果表明，差異基因主要參與的生物學(xué)過程有骨髓白細(xì)胞遷移、白細(xì)胞遷移的正調(diào)控、白細(xì)胞趨化、白細(xì)胞趨化的調(diào)控等。KEGG通路富集也發(fā)現(xiàn)，差異基因主要涉及的通路有TNF信號通路、IL-17信號通路、NF-κB信號通路、趨化因子信號通路、Toll樣受體信號通路等。上述結(jié)果表明，在gal-3的影響下，OA軟骨細(xì)胞內(nèi)的炎性細(xì)胞遷移增加，炎性因子及趨化因子信號通路被激活，大量炎性細(xì)胞在趨化因子的作用下匯聚于病變的軟骨組織，為軟骨組織的破壞埋下隱患。針對差異基因的疾病富集分析結(jié)果提示，差異基因主要富集的疾病有關(guān)節(jié)病、肺疾病、萊姆關(guān)節(jié)炎等，這與筆者預(yù)期的結(jié)果相一致。

在STRING數(shù)據(jù)庫與Cytoscape軟件中，筆者構(gòu)建了差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)，并利用cytoHubba插件找出了degree最高的10個核心基因，從高到低分別有IL-6、TNF、CXCL10、CXCL8、IL-1β、CXCL1、C3、CCL20、CXCL2、CCL2。既往研究表明，應(yīng)用托珠單抗阻斷IL-6受體可增加缺血性骨壞死小鼠的骨含量，與此同時，托珠單抗在分子水平上可促進(jìn)缺血誘導(dǎo)后小鼠體內(nèi)的軟骨合成代謝和骨重建[12]。PANINA等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與健康受試者相比，早期和晚期創(chuàng)傷性膝OA患者循環(huán)炎癥因子IL-6的水平升高。我們尋找的核心基因中IL-6度值最高，聯(lián)系先前的研究結(jié)果，進(jìn)一步說明IL-6在OA中發(fā)揮重要的作用。

綜上所述，gal-3在OA中主要發(fā)揮促炎作用，通過上調(diào)IL-6等相關(guān)基因的表達(dá)從而加重OA的疾病程度，在OA的進(jìn)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

4 參考文獻(xiàn)

[1] BLANEY DAVIDSON EN，VAN CAAM AP，VAN DER KRAAN PM.Osteoarthritis year in review 2016：biology[J].

Osteoarthritis Cartilage，2017，25（2）：175-180.

[2] MOBASHERI A，BAY-JENSEN AC，VAN SPIL WE，et al.

Osteoarthritis Year in Review 2016：biomarkers （biochemical markers）[J].Osteoarthritis Cartilage，

2017，25（2）：199-208.

[3] NEOGI T.The epidemiology and impact of pain in osteoarthritis[J]. Osteoarthritis Cartilage，2013，21（9）：1145-1153.

[4] VARADY NH，GRODZINSKY AJ.Osteoarthritis year in review 2015：mechanics[J].Osteoarthritis Cartilage，2016，24（1）：27-35.

[5] 中華中醫(yī)藥學(xué)會.骨性關(guān)節(jié)炎[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2013，2（2）：71-72.

[6] HU Y，YELEHE-OKOUMA M，EA HK，et al.Galectin-3：A key player in arthritis[J].Joint Bone Spine，2017，84（1）：15-20.

[7] ARAD U，MADAR-BALAKIRSKI N，ANGEL-KORMAN A，et al.Galectin-3 is a sensor-regulator of toll-like receptor pathways in synovial fibroblasts[J].Cytokine，2015，73（1）：30-35.

[8] WANG JS，XIAO WW，ZHONG YS，et al.Galectin-3 deficiency protects lipopolysaccharide-induced chondrocytes injury via regulation of TLR4 and PPAR-gamma-mediated NF-kappaB signaling pathway[J].J Cell Biochem，2019，120（6）：10195-10204.

[9] YU G，WANG LG，HAN Y，et al.clusterProfiler：an R package for comparing biological themes among gene clusters[J].OMICS，2012，16（5）：284-287.

[10] WEINMANN D，SCHLANGEN K，ANDRE S，et al.Galectin-3 Induces a Pro-degradative/inflammatory Gene Signature in Human Chondrocytes，Teaming Up with Galectin-1 in Osteoarthritis Pathogenesis[J].Sci Rep，2016，16（6）：39112.

[11] ALAAEDDINE N，ANTONIOU J，MOUSSA M，et al.

The chemokine CCL20 induces proinflammatory and matrix degradative responses in cartilage[J].Inflamm Res，2015，64（9）：721-731.

[12] KAMIYA N，KUROYANAGI G，ARUWAJOYE O，et al.

IL-6 receptor blockade preserves articular cartilage and increases bone volume following ischemic osteonecrosis in immature mice[J].Osteoarthritis Cartilage，2019，27（2）：326-335.

[13] PANINA SB，KROLEVETS IV，MILYUTINA NP，et al.

Circulating levels of proinflammatory mediators as potential biomarkers of post-traumatic knee osteoarthritis development[J].J Orthop Traumatol，2017，18（4）：349-357.

收稿日期：2019-06-23;修回日期：2019-08-01