程誠,鄭瑞峰,王彥威
武警河南省總隊醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,鄭州 450000
食管癌是中國常見的惡性腫瘤,與其他胃腸道腫瘤相比,食管癌的惡性程度較高,預(yù)后相對較差[1]。腫瘤新血管生成對腫瘤的生長、進展和遠處轉(zhuǎn)移均至關(guān)重要。因此,腫瘤新血管生成被認為是衡量腫瘤惡性程度的重要指標(biāo)[2]。有研究顯示,腫瘤血管生成與食管癌的惡性程度呈正相關(guān)[3]。血管抑制蛋白(vasohibin,VASH)家族是一種新的血管生成負反饋調(diào)節(jié)因子,參與腫瘤的多種病理生理過程,主要由VASH1及其同系物VASH2兩個亞型組成,在血管生成的調(diào)節(jié)中具有重要作用,VASH1主要表達于血管內(nèi)皮細胞,通過血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor-2,F(xiàn)GF-2)等血管生成刺激因子誘導(dǎo)血管生成[4-5]。VASH2主要表達于腫瘤細胞和CD11b陽性單核細胞浸潤新生血管活躍的區(qū)域,有研究發(fā)現(xiàn),VASH1、VASH2是與腫瘤血管生成、惡性腫瘤發(fā)生有關(guān)的預(yù)后因子[6-7],但關(guān)于其在食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中作用的研究較少見。此外,關(guān)于ESCC組織中VASH1和VASH2表達的相關(guān)性及其與患者預(yù)后關(guān)系的研究較少見。本研究探討VASH1、VASH2表達與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系,以期為ESCC患者預(yù)后的預(yù)測提供新的思路,現(xiàn)報道如下。
選取2015年5月至2017年4月于武警河南省總隊醫(yī)院行根治性手術(shù)的ESCC患者。納入標(biāo)準:符合《中國早期食管鱗狀細胞癌及癌前病變篩查與診治共識(2015年·北京)》[8]中的相關(guān)診斷標(biāo)準,并經(jīng)病理學(xué)檢查證實為ESCC;患者意識清晰,無聽力、認知及溝通障礙。排除標(biāo)準:合并嚴重精神疾病;臨床資料不全;腫瘤已發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。根據(jù)納入和排除標(biāo)準,本研究共納入209例ESCC患者,其年齡為42~69歲,平均年齡為(64.81±2.09)歲;男172例,女37例;腫瘤部位:上段21例,中段118例,下段70例;腫瘤直徑為23~64 mm,平均腫瘤直徑為(49.41±5.08)mm;分化程度:高分化65例,中分化100例,低分化44例;淋巴管侵犯:陰性45例,陽性164例;靜脈侵犯:陰性65例,陽性144例;浸潤性生長:a17例,b162例,c30例;pT分期:T1期85例,T2期37例,T3期87例;pN分期:N0期70例,N1期63例,N2期62例,N3期9例,N4期5例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移枚數(shù):2.71±0.62;pTNM分期:Ⅰ期46例,Ⅱ期76例,Ⅲ期82例,Ⅳ期5例;未接受過輔助化療者95例,接受過輔助化療者114例。所有患者均由同一組具備5年以上臨床經(jīng)驗的醫(yī)師采用相同的手術(shù)方式進行治療,術(shù)后均行常規(guī)輔助治療。
手術(shù)標(biāo)本采用10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,蠟塊切成5 μm厚的切片。分離、水化后,120°C下蒸壓30 min,pH值為6.0。將樣品置于3%的氫過氧化物酶/甲醇中,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性,室溫保存10 min。采用5%山羊血清于室溫下孵育10 min??筕ASH1抗體和抗VASH2抗體以1∶500稀釋和1∶100稀釋的抗CD34抗體為原始抗體,采用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌后,4°C反應(yīng)過夜,室溫下以組織纖維單色染色MAX(M)作為二抗,室溫下反應(yīng)30 min。用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)四鹽酸鹽和0.005%雙氧水在50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中顯影,用蘇木精染色細胞核。用PBS代替原抗體作為CD34抗原、VASH1和VASH2的陰性對照。所有切片均進行HE染色。
采用抗CD34抗體,使用免疫組化染色方法顯示腫瘤內(nèi)微血管,對微血管密度最高的區(qū)域(熱點區(qū)域)進行低倍率(×40)掃視,選取5個微血管密度最高的熱點區(qū)域,用高放大倍率(×200,0.74 mm)計數(shù)5個區(qū)域染色的微血管數(shù)量,取其平均值表示MVD值,該熱點為VASH1陽性血管。MVD陽性表達定位于血管內(nèi)皮細胞膜,呈棕褐色表達,陽性表達的單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇與鄰近血管、腫瘤細胞及其他結(jié)締組織成分清楚分開即為1個可計數(shù)的微血管,然后將每個熱點區(qū)域的血管數(shù)量轉(zhuǎn)換為每一平方毫米的數(shù)字,為微血管密度(microvessel density,MVD)值[9]。
VASH1和VASH2陽性染色定位于細胞質(zhì),呈棕黃色顆粒沉淀,根據(jù)其陽性細胞所占百分比進行評分:陽性細胞所占百分比為0%計0分,1%~50%計1分,51%~100%計2分。
每6個月對全部患者進行1次隨訪,隨訪截至2018年12月18日,隨訪內(nèi)容包括內(nèi)鏡、計算機斷層掃描(CT)、超聲檢查和血液檢測(檢測腫瘤標(biāo)志物水平)。
采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計數(shù)資料以例數(shù)和率(%)表示,組間比較采用χ2檢驗;計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差(±s)表示。采用Cox比例風(fēng)險回歸模型對ESCC患者總生存期和無病生存期的影響因素進行單因素和多因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
單因素分析結(jié)果顯示,靜脈侵犯、pN分期、VASH1高表達和VASH2高表達均可能是ESCC患者總生存期的影響因素(P<0.05),而年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑、浸潤性生長情況、MVD值和輔助化療情況均可能與ESCC患者的總生存期無關(guān)(P>0.05)。(表1)
表1 ESCC患者總生存期影響因素的單因素分析
將單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的變量納入Cox比例風(fēng)險回歸模型中進行多因素分析,結(jié)果顯示,靜脈侵犯陽性、pN分期為N1~4期、VASH1高表達和VASH2高表達均是ESCC患者總生存期的獨立危險因素(P<0.05)。(表2)
表2 ESCC患者總生存期影響因素的多因素分析
單因素分析結(jié)果顯示,靜脈侵犯、pN分期和VASH1表達情況均可能是ESCC患者無病生存期的影響因素(P<0.05),年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑、浸潤性生長情況和MVD值均可能與ESCC患者的無病生存期無關(guān)(P>0.05)。(表3)
表3 ESCC患者無病生存期的單因素分析
將單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的變量納入Cox比例風(fēng)險回歸模型中進行多因素分析,結(jié)果顯示,靜脈侵犯陽性、pN分期為N1~4期和VASH1高表達均是ESCC患者無病生存期的獨立危險因素(P<0.05)。(表4)
表4 ESCC患者無病生存期的多因素分析
血管生成是指在現(xiàn)有血管的基礎(chǔ)上形成新的血管網(wǎng)絡(luò)的現(xiàn)象。腫瘤血管生成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和遠處轉(zhuǎn)移中起重要作用[10]。近年來,關(guān)于惡性腫瘤血管生成與患者預(yù)后的關(guān)系已有多篇報道,加速了血管生成抑制劑的發(fā)展和臨床應(yīng)用。VASH1參與血管生成的抑制過程,有研究認為其不僅表達于生理性血管生成過程中,且表達于病理性血管生成的疾病中[11]。VASH1在乳腺癌、肝細胞癌、尿路上皮癌、前列腺癌、大腸癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌和頭頸部鱗狀細胞癌等惡性腫瘤中均表達[12],VASH1高表達患者的預(yù)后較差。有研究顯示,VASH1蛋白陽性表達ESCC患者的中位生存時間明顯短于VASH1蛋白陰性表達患者,VASH1為ESCC患者預(yù)后的影響因素[13-14]。
本研究認為VASH1和VASH2表達可能能夠用于預(yù)測ESCC患者的預(yù)后。VASH1表達于血管生成部位的血管內(nèi)皮細胞,CD34在新生和非新生的血管內(nèi)皮細胞中均表達?;诖颂攸c,可通過確定兩種血管類型的比例計算新生血管在所有血管中的比例,從而反映血管生成的活性。由于VASH1是一種血管生成抑制因子,高表達的VASH1可能能夠抑制血管的生成,從而改善患者預(yù)后。然而,亦有研究表明,VASH1過表達與患者的預(yù)后較差有關(guān),這可能與VASH1是由VEGF和FGF-2誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞分泌的有關(guān)[15]。VASH1的強度與腫瘤細胞中VEGF的強度呈正相關(guān),然而,VASH1在腫瘤微環(huán)境中分泌后會被降解和滅活。因此,VASH1在內(nèi)皮細胞中的免疫組化染色結(jié)果可能并不能明確其抗血管生成的活性,而僅可反映內(nèi)皮細胞對血管生成刺激的反應(yīng)?;诖?,VASH1高表達患者的抗血管生成活性高于VASH1低表達的患者。
VASH2是VASH1的同系物,是親血管生成因子。VASH2具有促進腫瘤血管生成和腫瘤生長的作用。VASH2高表達的胰腺導(dǎo)管腺癌患者的預(yù)后相對較差[16]。同樣,本研究中VASH2陽性表達ESCC患者的預(yù)后較差。關(guān)于VASH2在ESCC中的表達情況與預(yù)后關(guān)系的研究目前較少見[17],本研究為VASH2的研究提供了有價值參考依據(jù)。有研究發(fā)現(xiàn),VASH2的自分泌和旁分泌作用模式可通過上調(diào)肝癌細胞中核因子-κB的表達從而促進FGF-2和VEGF的表達[18]。VASH2不僅可促進腫瘤血管的生成,還可促進腫瘤細胞的增殖。VASH2可通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路,促進腫瘤細胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,因此,VASH2還參與腫瘤細胞的侵襲和遷移等多種生物學(xué)行為,并影響患者的預(yù)后。有研究發(fā)現(xiàn),ESCC組織中VASH1和VASH2的表達水平均未升高,惡性程度相對較低,患者預(yù)后較好[19-20]。
綜上所述,VASH1和VASH2高表達均是預(yù)測ESCC患者預(yù)后不良的獨立危險因素,聯(lián)合檢測VASH1和VASH2的表達情況有助于ESCC的臨床診治與預(yù)后預(yù)測。