程誠，鄭瑞峰，王彥威

武警河南省總隊醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，鄭州 450000

食管癌是中國常見的惡性腫瘤，與其他胃腸道腫瘤相比，食管癌的惡性程度較高，預(yù)后相對較差[1]。腫瘤新血管生成對腫瘤的生長、進展和遠處轉(zhuǎn)移均至關(guān)重要。因此，腫瘤新血管生成被認為是衡量腫瘤惡性程度的重要指標(biāo)[2]。有研究顯示，腫瘤血管生成與食管癌的惡性程度呈正相關(guān)[3]。血管抑制蛋白（vasohibin，VASH）家族是一種新的血管生成負反饋調(diào)節(jié)因子，參與腫瘤的多種病理生理過程，主要由VASH1及其同系物VASH2兩個亞型組成，在血管生成的調(diào)節(jié)中具有重要作用，VASH1主要表達于血管內(nèi)皮細胞，通過血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2）等血管生成刺激因子誘導(dǎo)血管生成[4-5]。VASH2主要表達于腫瘤細胞和CD11b陽性單核細胞浸潤新生血管活躍的區(qū)域，有研究發(fā)現(xiàn)，VASH1、VASH2是與腫瘤血管生成、惡性腫瘤發(fā)生有關(guān)的預(yù)后因子[6-7]，但關(guān)于其在食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中作用的研究較少見。此外，關(guān)于ESCC組織中VASH1和VASH2表達的相關(guān)性及其與患者預(yù)后關(guān)系的研究較少見。本研究探討VASH1、VASH2表達與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系，以期為ESCC患者預(yù)后的預(yù)測提供新的思路，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年5月至2017年4月于武警河南省總隊醫(yī)院行根治性手術(shù)的ESCC患者。納入標(biāo)準：符合《中國早期食管鱗狀細胞癌及癌前病變篩查與診治共識（2015年·北京）》[8]中的相關(guān)診斷標(biāo)準，并經(jīng)病理學(xué)檢查證實為ESCC；患者意識清晰，無聽力、認知及溝通障礙。排除標(biāo)準：合并嚴重精神疾病；臨床資料不全；腫瘤已發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。根據(jù)納入和排除標(biāo)準，本研究共納入209例ESCC患者，其年齡為42～69歲，平均年齡為（64.81±2.09）歲；男172例，女37例；腫瘤部位：上段21例，中段118例，下段70例；腫瘤直徑為23～64 mm，平均腫瘤直徑為（49.41±5.08）mm；分化程度：高分化65例，中分化100例，低分化44例；淋巴管侵犯：陰性45例，陽性164例；靜脈侵犯：陰性65例，陽性144例；浸潤性生長：a17例，b162例，c30例；pT分期：T1期85例，T2期37例，T3期87例；pN分期：N0期70例，N1期63例，N2期62例，N3期9例，N4期5例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移枚數(shù)：2.71±0.62；pTNM分期：Ⅰ期46例，Ⅱ期76例，Ⅲ期82例，Ⅳ期5例；未接受過輔助化療者95例，接受過輔助化療者114例。所有患者均由同一組具備5年以上臨床經(jīng)驗的醫(yī)師采用相同的手術(shù)方式進行治療，術(shù)后均行常規(guī)輔助治療。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法

手術(shù)標(biāo)本采用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，蠟塊切成5 μm厚的切片。分離、水化后，120°C下蒸壓30 min，pH值為6.0。將樣品置于3%的氫過氧化物酶/甲醇中，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫保存10 min。采用5%山羊血清于室溫下孵育10 min?？筕ASH1抗體和抗VASH2抗體以1∶500稀釋和1∶100稀釋的抗CD34抗體為原始抗體，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌后，4°C反應(yīng)過夜，室溫下以組織纖維單色染色MAX（M）作為二抗，室溫下反應(yīng)30 min。用3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）四鹽酸鹽和0.005%雙氧水在50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH7.5）中顯影，用蘇木精染色細胞核。用PBS代替原抗體作為CD34抗原、VASH1和VASH2的陰性對照。所有切片均進行HE染色。

1.3 MVD 計數(shù)標(biāo)準

采用抗CD34抗體，使用免疫組化染色方法顯示腫瘤內(nèi)微血管，對微血管密度最高的區(qū)域（熱點區(qū)域）進行低倍率（×40）掃視，選取5個微血管密度最高的熱點區(qū)域，用高放大倍率（×200，0.74 mm）計數(shù)5個區(qū)域染色的微血管數(shù)量，取其平均值表示MVD值，該熱點為VASH1陽性血管。MVD陽性表達定位于血管內(nèi)皮細胞膜，呈棕褐色表達，陽性表達的單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇與鄰近血管、腫瘤細胞及其他結(jié)締組織成分清楚分開即為1個可計數(shù)的微血管，然后將每個熱點區(qū)域的血管數(shù)量轉(zhuǎn)換為每一平方毫米的數(shù)字，為微血管密度（microvessel density，MVD）值[9]。

1.4 染色結(jié)果判定標(biāo)準

VASH1和VASH2陽性染色定位于細胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒沉淀，根據(jù)其陽性細胞所占百分比進行評分：陽性細胞所占百分比為0%計0分，1%～50%計1分，51%～100%計2分。

1.5 隨訪

每6個月對全部患者進行1次隨訪，隨訪截至2018年12月18日，隨訪內(nèi)容包括內(nèi)鏡、計算機斷層掃描（CT）、超聲檢查和血液檢測（檢測腫瘤標(biāo)志物水平）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示。采用Cox比例風(fēng)險回歸模型對ESCC患者總生存期和無病生存期的影響因素進行單因素和多因素分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC 患者總生存期影響因素的單因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，靜脈侵犯、pN分期、VASH1高表達和VASH2高表達均可能是ESCC患者總生存期的影響因素（P＜0.05），而年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑、浸潤性生長情況、MVD值和輔助化療情況均可能與ESCC患者的總生存期無關(guān)（P＞0.05）。（表1）

表1 ESCC患者總生存期影響因素的單因素分析

2.2 ESCC 患者總生存期影響因素的多因素分析

將單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的變量納入Cox比例風(fēng)險回歸模型中進行多因素分析，結(jié)果顯示，靜脈侵犯陽性、pN分期為N1～4期、VASH1高表達和VASH2高表達均是ESCC患者總生存期的獨立危險因素（P＜0.05）。（表2）

表2 ESCC患者總生存期影響因素的多因素分析

2.3 ESCC 患者無病生存期影響因素的單因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，靜脈侵犯、pN分期和VASH1表達情況均可能是ESCC患者無病生存期的影響因素（P＜0.05），年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑、浸潤性生長情況和MVD值均可能與ESCC患者的無病生存期無關(guān)（P＞0.05）。（表3）

表3 ESCC患者無病生存期的單因素分析

2.4 ESCC患者無病生存期影響因素的多因素分析

將單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的變量納入Cox比例風(fēng)險回歸模型中進行多因素分析，結(jié)果顯示，靜脈侵犯陽性、pN分期為N1～4期和VASH1高表達均是ESCC患者無病生存期的獨立危險因素（P＜0.05）。（表4）

表4 ESCC患者無病生存期的多因素分析

3 討論

血管生成是指在現(xiàn)有血管的基礎(chǔ)上形成新的血管網(wǎng)絡(luò)的現(xiàn)象。腫瘤血管生成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和遠處轉(zhuǎn)移中起重要作用[10]。近年來，關(guān)于惡性腫瘤血管生成與患者預(yù)后的關(guān)系已有多篇報道，加速了血管生成抑制劑的發(fā)展和臨床應(yīng)用。VASH1參與血管生成的抑制過程，有研究認為其不僅表達于生理性血管生成過程中，且表達于病理性血管生成的疾病中[11]。VASH1在乳腺癌、肝細胞癌、尿路上皮癌、前列腺癌、大腸癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌和頭頸部鱗狀細胞癌等惡性腫瘤中均表達[12]，VASH1高表達患者的預(yù)后較差。有研究顯示，VASH1蛋白陽性表達ESCC患者的中位生存時間明顯短于VASH1蛋白陰性表達患者，VASH1為ESCC患者預(yù)后的影響因素[13-14]。

本研究認為VASH1和VASH2表達可能能夠用于預(yù)測ESCC患者的預(yù)后。VASH1表達于血管生成部位的血管內(nèi)皮細胞，CD34在新生和非新生的血管內(nèi)皮細胞中均表達?；诖颂攸c，可通過確定兩種血管類型的比例計算新生血管在所有血管中的比例，從而反映血管生成的活性。由于VASH1是一種血管生成抑制因子，高表達的VASH1可能能夠抑制血管的生成，從而改善患者預(yù)后。然而，亦有研究表明，VASH1過表達與患者的預(yù)后較差有關(guān)，這可能與VASH1是由VEGF和FGF-2誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞分泌的有關(guān)[15]。VASH1的強度與腫瘤細胞中VEGF的強度呈正相關(guān)，然而，VASH1在腫瘤微環(huán)境中分泌后會被降解和滅活。因此，VASH1在內(nèi)皮細胞中的免疫組化染色結(jié)果可能并不能明確其抗血管生成的活性，而僅可反映內(nèi)皮細胞對血管生成刺激的反應(yīng)?；诖?，VASH1高表達患者的抗血管生成活性高于VASH1低表達的患者。

VASH2是VASH1的同系物，是親血管生成因子。VASH2具有促進腫瘤血管生成和腫瘤生長的作用。VASH2高表達的胰腺導(dǎo)管腺癌患者的預(yù)后相對較差[16]。同樣，本研究中VASH2陽性表達ESCC患者的預(yù)后較差。關(guān)于VASH2在ESCC中的表達情況與預(yù)后關(guān)系的研究目前較少見[17]，本研究為VASH2的研究提供了有價值參考依據(jù)。有研究發(fā)現(xiàn)，VASH2的自分泌和旁分泌作用模式可通過上調(diào)肝癌細胞中核因子-κB的表達從而促進FGF-2和VEGF的表達[18]。VASH2不僅可促進腫瘤血管的生成，還可促進腫瘤細胞的增殖。VASH2可通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路，促進腫瘤細胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，因此，VASH2還參與腫瘤細胞的侵襲和遷移等多種生物學(xué)行為，并影響患者的預(yù)后。有研究發(fā)現(xiàn)，ESCC組織中VASH1和VASH2的表達水平均未升高，惡性程度相對較低，患者預(yù)后較好[19-20]。

綜上所述，VASH1和VASH2高表達均是預(yù)測ESCC患者預(yù)后不良的獨立危險因素，聯(lián)合檢測VASH1和VASH2的表達情況有助于ESCC的臨床診治與預(yù)后預(yù)測。