許惠敏,馬志英,郭楠
開封市兒童醫(yī)院兒童重癥監(jiān)護(hù)室,河南 開封 475000
鐵元素是細(xì)胞增殖所必須的元素,與細(xì)胞周期調(diào)控、遺傳物質(zhì)合成和表達(dá)、能量代謝等均有密切關(guān)系[1]。鐵蛋白(ferritin,SF)是水溶性氧化鐵磷酸化合物,其主要功能為儲(chǔ)存鐵。研究表明,鐵代謝異常與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[2]。腫瘤組織分化早期,幼稚細(xì)胞增殖與分化需要大量鐵元素參與,腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor,TFR)大量表達(dá),因而推測(cè)轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,TF)、TFR可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著一定聯(lián)系,可用于評(píng)估腫瘤的侵襲程度。本研究對(duì)急性白血病患兒血清TFR的表達(dá)情況進(jìn)行分析,并對(duì)其與白血病患兒臨床特征、療效和預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行探討,現(xiàn)報(bào)道如下。
選取2015年1月至2018年1月開封市兒童醫(yī)院收治的82例急性白血病患兒為觀察組,所有患兒均經(jīng)外周血細(xì)胞分析、骨髓形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)等檢查確診為急性白血??;符合急性髓系白血?。◤?fù)發(fā)難治性)中國診療指南(2011年版)[3]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn),且均未合并其他系統(tǒng)腫瘤、肝腎功能嚴(yán)重不全、認(rèn)知障礙或精神疾病。觀察組中,男52例,女30例;年齡2~16歲,平均(10.95±4.27)歲;疾病類型:急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia,ALL)31例,急性髓細(xì)胞性白血病(acute myeloid leukemia,AML)51例;初診53例,復(fù)發(fā)29例;白細(xì)胞(white blood cell,WBC)計(jì)數(shù)為(16~128)×109/L,平均WBC計(jì)數(shù)為(32.15±26.34)×109/L;白血病細(xì)胞計(jì)數(shù)為(0.62~1.35)×109/L,平均白血病細(xì)胞計(jì)數(shù)為(1.05±0.31)×109/L;白血病危險(xiǎn)分級(jí):低危20例,中危29例,高危33例。另外,選取同期于開封市兒童醫(yī)院行健康體檢的健康兒童50例為對(duì)照組,均排除缺鐵性貧血、先天性TF缺乏等疾?。粚?duì)照組中,男29例,女21例;年齡1~15歲,平均(11.03±5.02)歲。兩組受試者的年齡、性別比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),所有受試者及家屬均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。
采集觀察組患兒入院2天內(nèi)及對(duì)照組受試者體檢時(shí)的清晨空腹靜脈血5 ml,分別注入2個(gè)試管中,一份用于檢測(cè)血清中SF、TF、TFR蛋白水平,一份用于檢測(cè)TFRmRNA水平。采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunoreaction,ELISA)法檢測(cè)血清SF、TF、TFR蛋白水平,試劑盒購自Beckman公司。TFRmRNA檢測(cè)標(biāo)本經(jīng)過硼酸鈉溶液重懸,加入淋巴細(xì)胞分離液,經(jīng)離心后取中間白霧狀即單個(gè)核細(xì)胞層,經(jīng)磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌、離心,去上清,加入3 ml PBS緩沖液,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。收集細(xì)胞加入0.5 ml TRIzol試劑(購自美國Invitrogen公司),經(jīng)勻漿、離心處理后取無色水相層,沉淀RNA,再次離心取沉淀物,洗滌,離心棄上清,室溫下晾至沉淀物干燥,Nanodrop ND-2000紫外分光光度法鑒定RNA純度和完整性。Reverse Transcription Ki(t購自美國GIBICOL公司)將符合A260nm/A280nm≥1.8的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)系統(tǒng)定量7500 PCR儀(購自美國ABI公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase,RT-PCR)反應(yīng),Primer Premier 6.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。瓊脂糖凝膠電泳,以β-actin作為內(nèi)參,紫外燈下觀察結(jié)果。2-ΔΔCt法計(jì)算TFRmRNA的相對(duì)表達(dá)量。RT-PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s,72 ℃ 35 s,共32個(gè)循環(huán)。
AML患兒采用高三尖杉酯堿+阿糖胞苷治療,ALL患兒采用柔紅霉素+長春新堿+強(qiáng)的松+門冬酰胺酶治療。療效評(píng)價(jià):治療結(jié)束2周,骨髓穿刺復(fù)查骨髓細(xì)胞形態(tài),參照血液病學(xué)診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[4]分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、未緩解(NR)。所有患兒均隨訪至2019年1月,統(tǒng)計(jì)患兒死亡、腫瘤復(fù)發(fā)的比例,及無疾病進(jìn)展生存率(progressive-free survival rate,PFS)。
采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),兩樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析TFRmRNA是否為急性白血病患兒預(yù)后的危險(xiǎn)因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
觀察組受試者血清中SF、TF、TFR蛋白水平均明顯高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);觀察組受試者的TFRmRNA水平明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(表1)
表1 不同組別受試者血清SF、TF、TFR蛋白和TFR mRNA水平的比較(±s)
表1 不同組別受試者血清SF、TF、TFR蛋白和TFR mRNA水平的比較(±s)
組別觀察組(n=82)對(duì)照組(n=50)t值P值SF(ng/ml)361.24±32.15 102.01±16.32 52.952 0.000 TF(g/L)3.67±0.25 2.13±0.19 37.441 0.000 TFR(mg/L)3.26±0.62 1.13±0.43 21.348 0.000 TFR mRNA 3.26±0.43 1.03±0.25 33.363 0.000
不同WBC計(jì)數(shù)、白血病細(xì)胞計(jì)數(shù)、白血病危險(xiǎn)分級(jí)急性白血病患兒的TFRmRNA相對(duì)表達(dá)量比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);不同性別、年齡、白血病類型急性白血病患兒的TFRmRNA相對(duì)表達(dá)量比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(表2)
治療后,急性白血病患兒的TFRmRNA相對(duì)表達(dá)量為(1.85±0.35),明顯低于治療前的(3.29±0.43),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.159,P<0.01)。治療后,82例急性白血病患兒中,CR 35例,PR 29例,NR 18例,分別作為CR組、PR組和NR組;CR組、PR組、NR組患兒的TFRmRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為(2.43±0.26)、(3.33±0.45)、(4.71±0.52),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=195.181,P<0.01);CR組急性白血病患兒的TFRmRNA相對(duì)表達(dá)量低于PR組和NR組,PR組急性白血病患兒的TFRmRNA相對(duì)表達(dá)量低于NR組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.998、21.379、9.628,P<0.05)。
表2 不同臨床特征急性白血病患兒TFR mRNA水平的比較
截至隨訪結(jié)束,82例急性白血病患兒的隨訪時(shí)間為6~36個(gè)月,中位隨訪時(shí)間為25個(gè)月,隨訪期間6例患兒死亡,16例患兒復(fù)發(fā);PFS為73.2%(60/82);Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示,TFRmRNA為急性白血病患兒預(yù)后的危險(xiǎn)因素(RR=1.276,95%CI:1.105~1.467,χ2=13.562,P<0.05)。
鐵是人體發(fā)育所必需的微量元素,鐵通過腸道吸收與TF結(jié)合輸送至全身,并與TFR結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),參與細(xì)胞的生長、增殖等過程。鐵代謝異常可影響正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的增殖,導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)貧血和免疫力下降[5],因此,鐵代謝異常被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一。SF作為反映機(jī)體貯存鐵的指標(biāo),與肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6-7]。相關(guān)研究表明,乳腺癌患者血清中SF呈高表達(dá)狀態(tài),且其表達(dá)水平與乳腺癌患者的病理分級(jí)密切相關(guān),表明血清SF在乳腺癌診斷中可能具有較高的臨床價(jià)值[8-9]。白血病屬于造血系統(tǒng)惡性腫瘤,患者多出現(xiàn)貧血、感染等癥狀,白血病細(xì)胞可浸潤機(jī)體的各個(gè)組織器官,導(dǎo)致多臟器、系統(tǒng)功能衰竭,臨床病死率較高[10-11]。血清TFR與急性白血病是否存在某種聯(lián)系尚需更多臨床研究證實(shí)。
本研究結(jié)果顯示,觀察組患兒的血清SF、TF、TFR蛋白水平及TFRmRNA水平均明顯高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);其原因可能為白血病患兒機(jī)體鐵處于高度代謝狀態(tài),腫瘤細(xì)胞大量增殖、分化均需要大量鐵元素參與,因此急性白血病患兒TFR表達(dá)水平明顯升高,以促進(jìn)鐵元素向腫瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn),不同WBC計(jì)數(shù)、白血病細(xì)胞計(jì)數(shù)、白血病危險(xiǎn)分級(jí)急性白血病患兒的TFRmRNA相對(duì)表達(dá)量比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);提示TFRmRNA水平與急性白血病患兒的病情嚴(yán)重程度、危險(xiǎn)程度密切相關(guān),TFRmRNA水平可以反映白血病患兒的病情。相關(guān)研究指出,白細(xì)胞可以分泌白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-6等炎性因子,炎性因子與細(xì)胞膜受體結(jié)合可以促進(jìn)TFR轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外,白血病患兒機(jī)體炎癥程度越高,血清TFR水平越高,患兒貧血程度越嚴(yán)重,患兒的病情危險(xiǎn)程度越大[12-14];還有研究顯示,白血病患兒白血病細(xì)胞數(shù)量增多時(shí),TF的合成和分泌也增多,導(dǎo)致血清TF水平明顯升高[15-16]。本研究結(jié)果顯示,白血病細(xì)胞計(jì)數(shù)高(≥0.8×109/L)的急性白血病患兒TFRmRNA表達(dá)水平高于白血病細(xì)胞計(jì)數(shù)低(<0.8×109/L)的患兒(P<0.05),提示TFRmRNA可能可以用于評(píng)估急性白血病患兒的病情。
本研究對(duì)TFRmRNA表達(dá)水平與急性白血病患兒臨床療效的關(guān)系進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),治療后,急性白血病患兒的TFRmRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于治療前(P<0.01),且CR組患兒的TFRmRNA相對(duì)表達(dá)量低于PR組和NR組(P<0.05),表明化療后,急性白血病患兒的鐵代謝程度降低,貧血癥狀改善,提示TFRmRNA可以較好地反映白血病患兒的臨床治療效果,與相關(guān)研究結(jié)果一致[17-18]。已有研究顯示,SF相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)在成人白血病的療效評(píng)估中具有較好的價(jià)值[19],但關(guān)于TFRmRNA與急性白血病患兒預(yù)后關(guān)系的研究較少。本研究對(duì)82例急性白血病患兒進(jìn)行隨訪,并經(jīng)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析,結(jié)果顯示TFRmRNA為急性白血病患兒預(yù)后的危險(xiǎn)因素,提示TFRmRNA表達(dá)水平越低,患兒的PFS越高,TFRmRNA是影響白血病患兒預(yù)后的重要危險(xiǎn)因素。翟勇等[20]對(duì)50例乳腺癌患者的血清TFR水平與5年生存率的關(guān)系進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)生存患者的血清TFR水平低于死亡患者,血清TFR水平與患者的5年生存率呈負(fù)相關(guān),與本研究結(jié)果相似。上述研究結(jié)果提示,TFRmRNA表達(dá)水平與急性白血病患兒的預(yù)后有關(guān),可能作為評(píng)價(jià)白血病患兒預(yù)后的重要指標(biāo)。
綜上所述,急性白血病患兒TFRmRNA水平明顯增高,其表達(dá)水平與患兒的病情嚴(yán)重程度、臨床療效和預(yù)后均密切相關(guān),臨床可通過檢測(cè)TFRmRNA水平輔助診斷急性白血病、評(píng)估患者病情、評(píng)價(jià)臨床療效和預(yù)測(cè)預(yù)后。