王騰，金琳芳，華東

無錫市第四人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇 無錫 214062

胃癌是消化系統(tǒng)常見的一種惡性腫瘤，早期胃癌缺乏特異性臨床表現(xiàn)，容易與胃潰瘍、胃炎等疾病混淆，具有較高的發(fā)病率和病死率，嚴(yán)重威脅著患者的生命安全[1]。盡管目前胃癌的綜合治療方案已不斷完善，但是患者的病死率仍未得到明顯改善，而復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌患者死亡的重要原因之一。相關(guān)研究表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期等病理特征均能夠一定程度反映腫瘤的進(jìn)展情況，評估患者預(yù)后，但是目前臨床尚缺乏對胃癌高危人群篩選、診治的典型標(biāo)志物[2]。細(xì)胞癌變是一個多因素及多階段過程；近年來研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶在細(xì)胞癌變過程中具有重要作用，其可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì)，參與細(xì)胞的遷移及侵襲過程[3]。絲氨酸蛋白酶1（high temperature requirement factor 1，HTRA1）廣泛表達(dá)于機(jī)體組織中；研究表明，HTRA1在宮頸癌等腫瘤中表達(dá)缺失或下調(diào)，提示其可能具有抑瘤作用[4]。Miyamoto等[5]研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸蛋白酶表達(dá)降低能夠影響卵巢癌患者對化療藥物的細(xì)胞毒性作用，引起細(xì)胞化療耐受。還有研究報道，HTRA1表達(dá)下調(diào)可能與腫瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)[6]。但是，目前關(guān)于HTRA1與胃癌關(guān)系的系統(tǒng)研究尚缺乏，因而本研究探討了胃癌組織中HTRA1的表達(dá)情況及其臨床意義，旨在為胃癌的臨床診治提供參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2012年1月至2014年7月于無錫市第四人民醫(yī)院行根治性手術(shù)的胃癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床表現(xiàn)、血液腫瘤標(biāo)志物檢測、影像學(xué)檢查、病理組織學(xué)檢查等確診為胃癌[7]；②術(shù)前未行放化療、靶向治療等抗腫瘤治療；③未合并其他部位惡性腫瘤；④病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重肝腎功能不全；②胃癌復(fù)發(fā)患者。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入胃癌患者87例。其中，男52例，女35例；年齡41～72歲，平均（57.85±6.94）歲；腫瘤部位：幽門51例，胃體部25例，賁門11例；分化程度：低分化40例，中高分化47例；幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）感染陽性 31例，HP感染陰性 56例；浸潤深度：T1～229例，T3～458 例；腫瘤直徑：P＜5 cm 36例，≥5 cm 51例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ期69例。收集所有患者的胃癌組織和癌旁組織（距離腫瘤病灶5 cm以外的正常胃組織）標(biāo)本，本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測不同組織中HTRA1的表達(dá)情況

取胃癌患者的胃癌組織和癌旁組織，置于液氮中并轉(zhuǎn)移至-80℃低溫箱中保存待用。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測不同組織中HTRA1的表達(dá)情況，石蠟標(biāo)本進(jìn)行4 μm層厚連續(xù)切片，放置70℃KD-PIII型生物組織攤烤片機(jī)（購自蘇州景通儀器有限公司）中烘烤1.5 h。將切片進(jìn)行二甲苯脫蠟，并予以100%、90%、80%、70%的梯度乙醇水化。于蒸餾水中漂洗3 min，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次。于切片中加入3%H2O2去離子水孵育10 min，抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。以PBS沖洗3次，予以熱抗原修復(fù)，PBS沖洗3次。于切片中加入適當(dāng)比例稀釋小鼠抗人HTRA1單克隆抗體，放置于4℃冰箱中過夜。以PBS沖洗3次，加入通用性免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）多聚體，于室溫環(huán)境下放置30 min。以PBS沖洗3次，于每個切片中加入2滴剛配制的二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzine，DAB）溶液進(jìn)行顯色，于CX-40顯微鏡（購自日本Olympus公司）下調(diào)控顯色時間至陽性物質(zhì)出現(xiàn)棕黃色時，以自來水沖洗并終止顯色反應(yīng)。取蘇木素進(jìn)行復(fù)染，以自來水再次返藍(lán)，梯度乙醇以脫水干燥，二甲苯透明，中性樹脂進(jìn)行封片。免疫組化染色具體步驟參照鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果判定

HTRA1蛋白表達(dá)于細(xì)胞核中，陽性表達(dá)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒。采用雙評分半定量法對染色結(jié)果進(jìn)行評價，依據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行評分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評分：隨機(jī)選取每張切片的5個高倍鏡視野（×400），每個視野計數(shù)500個細(xì)胞，陽性細(xì)胞所占比例≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，≥76%計4分。將染色強(qiáng)度評分和陽性細(xì)胞所占比例評分的乘積作為最后評分，0分為陰性表達(dá)（-），1～4分為弱陽性表達(dá)（+），5～8分為中度陽性表達(dá)（++），9～12分為強(qiáng)陽性表達(dá)（+++）[8]，本研究將弱陽性、中度陽性和強(qiáng)陽性表達(dá)均歸為陽性表達(dá)。

1.4 隨訪

所有胃癌患者均以門診復(fù)診、電話等方式進(jìn)行為期5年的隨訪，以2019年7月30日為截止日期，刪失值為研究對象因其他原因死亡或失訪，記錄隨訪期間患者的生存情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用Log-rank檢驗；采用Cox風(fēng)險比例回歸模型對胃癌根治術(shù)后患者預(yù)后的影響因素進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HTRA1表達(dá)情況的比較

胃癌組織中HTRA1蛋白的陽性表達(dá)率為16.1%（14/87），明顯低于癌旁組織的85.1%（74/87），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=82.770，P＜0.01）。（表1）

表1 HTRA1在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況[n（%）]

2.2 胃癌組織中HTRA1表達(dá)與胃癌患者臨床特征的關(guān)系

不同性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、HP感染情況胃癌患者胃癌組織中HTRA1的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；浸潤深度為T3～4、腫瘤直徑≥5 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ期胃癌患者胃癌組織中HTRA1的陽性表達(dá)率分別低于浸潤深度為T1～2、腫瘤直徑＜5 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中HTRA1陽性表達(dá)情況的比較（n=87）

2.3 胃癌組織中HTRA1表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

截至隨訪結(jié)束，87例胃癌患者中，27例患者死亡。其中，14例HTRA1陽性患者中，1例患者死亡，平均生存時間為57（95%CI：56～60）個月；73例HTRA1陰性患者中，26例患者死亡，平均生存時間為 51（95%CI：48～54）個月；HTRA1 陽性胃癌患者的生存結(jié)局優(yōu)于HTRA1陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.016，P=0.045）。（圖1）

2.4 胃癌根治術(shù)后患者預(yù)后影響因素的多因素分析

以隨訪結(jié)束時患者是否死亡為因變量（死亡=1、生存=0），以浸潤深度、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期、HTRA1表達(dá)情況作為自變量，Cox比例風(fēng)險回歸模型結(jié)果顯示，浸潤深度為T3～4、腫瘤直徑≥5 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ期、HTRA1陰性是胃癌根治術(shù)后患者預(yù)后的獨立危險因素。（表3）

圖1 HTRA1陽性（n=14）和HTRA1陰性（n=73）表達(dá)胃癌患者的總生存曲線

表3 87例胃癌根治術(shù)后患者預(yù)后影響因素的多因素分析

3 討論

胃癌是臨床常見的一種惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和病死率，嚴(yán)重危及患者的生命安全，已成為重要的公共衛(wèi)生問題[9-10]。了解胃癌的發(fā)病機(jī)制，從而對胃癌進(jìn)行早期干預(yù)，對提高患者的療效，延長患者的生存期具有重要作用。近年來，隨著對胃癌分子生物學(xué)研究的不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的發(fā)生與多種基因和信號通路有關(guān)[11]。

HTRA1屬于人絲氨酸蛋白酶家族成員，廣泛存在于動物、植物及微生物體內(nèi)，可以參與細(xì)胞抵御熱休克、炎性反應(yīng)、氧化性應(yīng)激等生理病理過程[12]。已有研究發(fā)現(xiàn)，HTRA1可以參與腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移等過程，且其表達(dá)水平增高時可以明顯抑制腫瘤的生長[13]。相關(guān)研究表明，HTRA1表達(dá)下調(diào)能夠加快腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移[14]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HTRA1表達(dá)下調(diào)后能夠增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞間連接的能力，促進(jìn)細(xì)胞的重構(gòu)[15]。陳歡等[16]研究報道，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性；抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。相關(guān)研究顯示，HTRA1表達(dá)下調(diào)所致乳腺癌進(jìn)展，可能與其誘導(dǎo)腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)，抑制HTRA1表達(dá)能夠促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生侵襲和轉(zhuǎn)移能力[17]。還有研究表明，下調(diào)HTRA1表達(dá)可以通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子β表達(dá)，激活調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而參與細(xì)胞的增殖和分化過程[18]。既往研究已證實，活化的HTRA1能夠通過絲氨酸蛋白酶依賴方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而下調(diào)HTRA1表達(dá)能夠減少細(xì)胞毒性作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞化療耐受[19]。Zhao等[20]研究表明，HTRA1在對順鉑耐受的肺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)。HTRA1在子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤等多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)或缺失，且腫瘤進(jìn)展患者的HTRA1下調(diào)更為明顯，提示HTRA1下調(diào)與腫瘤進(jìn)展有一定相關(guān)性[21]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中HTRA1蛋白的陽性表達(dá)率明顯低于癌旁組織（P＜0.01），表明HTRA1表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生有關(guān)。

既往研究顯示，HRTA1和腫瘤生物學(xué)行為有關(guān)[22]。本研究結(jié)果顯示，浸潤深度為T3～4、腫瘤直徑≥5 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ期胃癌患者胃癌組織中HTRA1陽性表達(dá)率分別低于浸潤深度為T1～2、腫瘤直徑＜5 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期患者（P＜0.05），提示隨著腫瘤惡性程度的上升，HRTA1的表達(dá)有所下調(diào)。Miyamoto等[5]研究發(fā)現(xiàn)，HTRA1表達(dá)水平降低與惡性腫瘤患者的總生存情況有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，HTRA1陽性胃癌患者的生存結(jié)局優(yōu)于HTRA1陰性表達(dá)患者，提示HRTA1可能與胃癌患者的生存預(yù)后有關(guān)，考慮與HTRA1在胃癌細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，及抑制胃癌細(xì)胞增殖有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，浸潤深度為T3～4、腫瘤直徑≥5 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ期是胃癌根治術(shù)后患者預(yù)后的獨立危險因素，提示HRTA1在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌患者的多種生物學(xué)行為可能有關(guān)，可作為胃癌患者預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)之一。

綜上所述，胃癌組織中HTRA1的陽性表達(dá)率較低，且其表達(dá)水平與胃癌患者的浸潤深度、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，可作為胃癌患者預(yù)后預(yù)測的參考指標(biāo)，在臨床具有較高的應(yīng)用價值。但是本研究的樣本量少，因而有待更多樣本量的深入研究，以減少隨機(jī)誤差，增加結(jié)論的可靠性。