牛乳中頭孢菌素類抗生素檢測方法研究進展

李龍飛

（威海職業(yè)學院康養(yǎng)學院，山東 威海 264210）

隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，牛乳已成為越來越多消費者日常生活中的營養(yǎng)品。牛乳對于增強國民體質(zhì)、改善青少年營養(yǎng)與健康具有重要意義，與之相應的是牛乳的安全性也必須得到高度重視。頭孢菌素類抗生素是一類分子內(nèi)含有β-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)的半合成抗生素，具有抗菌譜廣、殺菌力強、毒副作用小、過敏反應少的優(yōu)點，在獸醫(yī)臨床和畜禽飼養(yǎng)中有廣泛應用[1]。然而，在乳牛飼養(yǎng)過程中，濫用或不規(guī)范使用頭孢菌素類藥物的情況時有發(fā)生，而其導致的牛乳中頭孢菌素類藥物殘留問題可能會對消費者健康造成危害，引發(fā)抗藥或過敏風險。鑒于頭孢菌素類抗生素的潛在風險，美國、日本、歐盟及國際食品法典委員會等都對牛乳中頭孢菌素類抗生素殘留制定了限量標準，其限量多為10～100 μg/kg[2]。我國農(nóng)業(yè)部235號公告規(guī)定，牛乳中頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢噻呋等頭孢菌素藥物最高殘留限量為20～100 μg/kg[3]。我國是乳制品消費大國，雖然人均消費量低于美國、日本等發(fā)達國家，但乳制品消費量連年持續(xù)增長，發(fā)展?jié)摿薮?，因此發(fā)展快速可靠的牛乳中藥物殘留檢測技術(shù)，確保消費者食品安全，對于保障乳品行業(yè)健康發(fā)展至關(guān)重要。

1 牛乳中頭孢菌素類抗生素殘留的潛在風險

由于頭孢菌素類抗生素的高效實用性，在乳牛飼養(yǎng)過程中往往用其預防或治療乳腺炎、肺炎、乳房細菌感染等疾病，以避免乳源產(chǎn)量和質(zhì)量下降，給藥方式多為飼喂或注射[4]。為防治乳牛疾病，大量或不規(guī)范使用頭孢菌素類抗生素、不嚴格執(zhí)行休藥期規(guī)定等情況時有發(fā)生，導致原料乳中頭孢菌素類藥物殘留超標，進而通過食物鏈傳遞累積，影響人類健康[5-6]。

牛乳中殘留的頭孢菌素類抗生素對人體的潛在危害主要有：1）引起過敏反應。長期攝入含頭孢菌素類抗生素殘留的牛乳可能破壞消費者腸道內(nèi)的菌群平衡，引發(fā)皮疹、哮喘、蕁麻疹等過敏反應[7]；2）損傷腎臟。關(guān)于頭孢菌素類抗生素對腎臟毒性的研究表明，頭孢菌素類藥物可能給腎臟帶來損害[8]；3）增強細菌耐藥性。頭孢菌素類抗生素殘留可誘導人體產(chǎn)生耐藥病源菌株，不利于消費者再使用抗生素治療相關(guān)疾病[9]。

2 牛乳樣品預處理方法

牛乳中含有蛋白質(zhì)、脂類、乳糖及維生素等成分，在預處理階段要盡可能除去干擾基質(zhì)，純化目標物。牛乳樣品預處理的常用方法有液-液萃取法、固相萃取法和QuEChERS（quick,easy,cheap,effective,rugged,safe）法等[10]。

2.1 液-液萃取法

液-液萃取是利用物質(zhì)在不同溶劑（溶劑互不相溶）中溶解度或分配系數(shù)差異實現(xiàn)分離的方法[11]，該方法易受實驗人員操作手法和熟練程度等因素影響，凈化提取效果不理想，有機溶劑消耗較大，應用范圍較為有限[12]。Dasenaki等[13]采用液-液萃取法，先向牛乳樣品中加入水（含0.1%甲酸、0.1%乙二胺四乙酸）、甲醇和乙腈體積比為1∶1∶1的混合液，通過漩渦振蕩、超聲提取、離心取上清液去除蛋白質(zhì)，隨后使用正己烷去除脂肪；采用超高效液相色譜（ultra high performance liquid chromatography，UPLC）-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜法建立魚類組織和牛乳中143 種獸藥（含頭孢菌素類藥物）的篩查方法，牛乳中的檢出水平為150 ng/mL。

2.2 固相萃取法

固相萃取是利用選擇性固體吸附劑將目標物先從液體樣品中分離，然后將其洗脫，以達到富集目標物和去除干擾基質(zhì)的目的[14]。與液-液萃取相比，固相萃取能夠更準確地將頭孢菌素類藥物殘留與干擾基質(zhì)分離，有效提高回收率，且有機溶劑消耗少，對環(huán)境相對友好，因此目前固相萃取法在頭孢菌素類藥物殘留的預處理中應用最為普遍。莫楠等[15]以5%甲酸-乙腈溶液作為提取劑，待測頭孢菌素類藥物經(jīng)Oasis PRIME HLB固相萃取柱分離純化，氮吹復溶后注入UPLC-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）儀，采用電噴霧離子源正離子模式及多反應監(jiān)測模式進行檢測，建立同時測定牛乳、乳粉、酸乳3 種乳制品中4 種頭孢菌素類藥物殘留的方法，結(jié)果表明，牛乳和酸乳中頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢洛寧和頭孢喹肟的定量限為4 μg/kg，乳粉中為32 μg/kg；4 種頭孢菌素類藥物添加量為4～150 μg/kg時的回收率為63.3%～112.1%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.6%～10.5%；基質(zhì)效應為108.77%～379.91%，方法檢測周期短，適用于多種乳制品檢測。

王建鳳等[16]將樣品用0.05 mol/L磷酸氫二鉀緩沖溶液提取，HLB固相萃取柱凈化，UPLC-MS/MS測定，采用多反應監(jiān)測模式進行定性和定量分析，建立同時測定牛乳中6 種頭孢菌素類抗生素的方法，結(jié)果表明，6 種待測頭孢菌素類抗生素的檢出限為0.05～0.40 μg/kg，定量限為0.1～1.6 μg/kg，乳樣加標回收率為66.3%～110.0%，方法高效、便捷，能夠滿足牛乳中頭孢菌素類抗生素的檢測。

除常規(guī)固相萃取外，一些新型固相萃取技術(shù)也應用于頭孢菌素類抗生素殘留檢測中，如分子印跡固相萃取技術(shù)、磁性固相萃取技術(shù)等[17]。

Quesada-Molina等[18]通過非共價分子印跡法，以三丁基銨-頭孢羥氨芐鹽（three butyl ammonium-cefadroxil，TBA-CFD）作為模板，以甲基丙烯酸作為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯作為交聯(lián)劑，在丙酮、甲醇體積比92∶8的混合液中制備頭孢氨芐和頭孢匹林的分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP），將制備的MIP用于固相萃取和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC），檢測頭孢菌素類藥物，結(jié)果表明，與非印跡聚合物相比，MIP對標準溶液及牛乳樣品中的頭孢氨芐、CFD和頭孢匹林更具選擇性，加標乳樣中3 種目標分析物的回收率均高于60%。

Liu Xiaodan等[19]采用具有C18官能化內(nèi)孔壁的磁芯孔殼微球作為固相萃取吸附劑，開發(fā)了一種快速、有效的提取方法，用于測定牛乳中頭孢菌素（頭孢唑啉、頭孢氨芐、頭孢哌酮）的殘留量。該方法無需蛋白質(zhì)沉淀過程，頭孢菌素藥物通過與中孔通道內(nèi)壁功能化的C18基團的疏水作用，直接吸附在C18-Fe3O4@mSiO2微球上，而牛乳樣品中豐富的蛋白質(zhì)則由于尺寸排阻效應被排除在外。通過磁鐵引入外加磁場，即可快速分離出吸附有頭孢菌素藥物的C18-Fe3O4@mSiO2微球，經(jīng)甲醇洗脫后，洗脫液注入HPLC-MS/MS儀進行分析，3 種頭孢菌素類抗生素的回收率為85%～115%，RSD為6.3%～10.8%，提取方法簡便快速、穩(wěn)定性好，適用于牛乳中頭孢菌素類藥物殘留的測定，為簡化和加快樣品制備步驟提供了有益的替代方案。

2.3 QuEChERS法

QuEChERS法是一種基于分散固相萃取建立起來的簡單、快速的樣品制備技術(shù)，相比于液-液萃取法和固相萃取法，QuEChERS法具有操作簡便、快速、準確、回收率高、有機試劑用量少等優(yōu)點，除了應用于農(nóng)藥殘留檢測，近年來在獸藥殘留檢測領(lǐng)域也有越來越多的應用[20]。張小剛等[21]將含有體積分數(shù)1%醋酸的乙腈加入牛乳樣品中，用以提取頭孢菌素類抗生素，氮吹濃縮、經(jīng)C18吸附劑凈化后，采用HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）分離，以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，在電噴霧離子源正離子模式下電離，多反應監(jiān)測模式下檢測，建立QuEChERS-UPLC-MS/MS法同時測定牛乳中6 種頭孢菌素類抗生素的分析方法。結(jié)果表明，所建立方法的檢出限為0.2～0.6 μg/kg，定量限為0.8～2.0 μg/kg，3 個加標量下6 種頭孢菌素類抗生素的回收率為75.1%～94.4%，RSD為0.63%～8.30%，方法快速簡便、準確度高，適用于牛乳中頭孢菌素類抗生素殘留的監(jiān)測。

3 牛乳中頭孢菌素類抗生素殘留檢測分析方法

當前針對牛乳中頭孢菌素類抗生素殘留的檢測分析方法大致分為儀器檢測法、免疫檢測法及微生物檢測法3 類[22]。其中儀器檢測法應用最為廣泛，免疫檢測法次之，微生物檢測法應用相對較少。

3.1 HPLC法

HPLC是一種利用不同組分在流動相和固定相中分配系數(shù)不同實現(xiàn)不同組分分離的技術(shù)，目前，HPLC在食品藥品檢測、化工原料檢驗及環(huán)境保護監(jiān)測等領(lǐng)域均有廣泛應用[23-24]。Karageorgou等[25]采用超聲輔助基質(zhì)固相分散法從牛乳中分離出8 種頭孢菌素（CFD、頭孢克洛、頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢哌酮和頭孢噻呋），通過HPLC進行多殘留物檢測及分析，結(jié)果表明，8 種頭孢菌素類抗生素的回收率為93.4%～115.3%，RSD小于15.3%。

3.2 HPLC-MS/MS法

HPLC-MS/MS是一種建立在物質(zhì)離子化基礎(chǔ)上通過荷質(zhì)比分離離子的檢測分析技術(shù)，雖然儀器價格昂貴，但檢出限低于HPLC，能夠更好地滿足牛乳中微量頭孢菌素類抗生素殘留的檢測需求[26-27]。

周昱等[28]使用乙腈提取牛乳樣品，離心后將上清液加入乙腈飽和的正己烷，振蕩，取乙腈層進行檢測分析，以ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）為分析柱，以乙腈和5 mmol/L乙酸銨為流動相，采用電噴霧離子源負離子模式進行電離，多反應監(jiān)測模式進行檢測，建立牛乳中頭孢尼西的HPLC-MS/MS快速測定方法，方法的檢出限為0.04 μg/L，定量限為0.15 μg/L，樣品3 個加標水平下的回收率為87.4%～93.5%，RSD為2.1%～4.5%。

3.3 UPLC-MS/MS法

UPLC是基于HPLC理論，采用更小的色譜柱填料粒徑和極低系統(tǒng)體積，極大提高了分析效率[29]。目前，UPLC-MS/MS已廣泛應用于獸藥的多殘留篩查，與HPLC相比，UPLC可以更加準確地定性與定量復雜混合物中的組分[30]。王曉燕[31]采用乙腈-水提取乳粉樣品，用正己烷除脂，提取液經(jīng)HLB固相萃取凈化，進行UPLC-MS/MS檢測，建立乳粉中頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉、頭孢噻呋、頭孢喹肟、頭孢匹羅及頭孢洛寧殘留的快速檢測方法，結(jié)果表明，7 種頭孢菌素類抗生素殘留的檢出限為10～20 μg/kg，定量限為20～40 μg/kg，加標回收率為62%～90%，RSD為3%～11%，方法測定準確度高，適用于乳粉中7 種頭孢菌素類藥物殘留的檢測。

3.4 免疫檢測法

常見的免疫檢測法有放射免疫標記法和酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法等，其中ELISA是當前牛乳檢測中使用最為廣泛、較為快速、靈敏的一種檢測方法[32-33]。與常規(guī)理化分析手段相比，免疫檢測法具有更高的特異性和靈敏度，但易出現(xiàn)假陽性結(jié)果限制了其應用[10]。卞素敏等[34]應用頭孢氨芐單克隆抗體，建立牛乳中頭孢氨芐殘留的間接ELISA檢測方法，線性檢測范圍為1.0～50.0 μg/L，檢出限為1.0 μg/L，半抑制質(zhì)量濃度為4.1 μg/L，牛乳樣品3 個加標量下的回收率為93.3%～98.2%，頭孢氨芐抗體與頭孢拉定、頭孢羥氨芐、頭孢克洛及頭孢克肟的交叉反應率分別為160.0%、80.0%、28.4%和3.7%，方法簡單、有效、精確度及準確度較高。

3.5 微生物檢測法

微生物檢測法經(jīng)濟、簡單，但由于其檢出限一般高于歐盟藥典規(guī)定的最大殘留量，限制了其進一步應用，目前微生物檢測法在頭孢菌素類抗生素殘留檢測領(lǐng)域的研究較少[22]。

李延華等[35]采用3 種微生物檢測法（氯化三苯基四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride，TTC）法、嗜熱脂肪芽孢桿菌紙片（Bacillus stearophilusdisk，BSDA）法、試管擴散法）對牛乳中6 種β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留進行檢測，確定了3 種方法對牛乳中常見β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留的檢出限、檢測時間、操作難易等參數(shù)。結(jié)果表明：BSDA法操作繁瑣、檢測時間長、效率較低；TTC法檢出限較高，不符合測定標準；試管擴散法在操作流程、檢測時間及檢出限等方面均優(yōu)于另外2 種微生物法，具有一定的應用價值。

4 結(jié) 語

近年來，國內(nèi)外食品安全事件頻發(fā)，牛乳作為人們?nèi)粘Ｉ攀车闹匾M成部分，確保其安全的重要性不言而喻。目前，針對牛乳中頭孢菌素類藥物殘留的檢測中，預處理方法多以固相萃取為主，檢測技術(shù)則以LC-MS/MS為首選。對于牛乳中頭孢菌素類藥物殘留的研究主要集中在通過儀器分析建立高通量的檢測方法，如飛行時間質(zhì)譜、軌道阱串聯(lián)質(zhì)譜等高分辨率技術(shù)，但大型精密儀器的購置、分析檢測及維護保養(yǎng)成本均較高，且高通量容易帶來特異性低等問題。因此，在保持高通量篩選的基礎(chǔ)上，開發(fā)特異性強的新型免疫分析檢測技術(shù)或成本低廉、操作簡便的小型便攜式檢測設(shè)備成為接下來的研究重點。隨著學科交叉相融和新技術(shù)的不斷出現(xiàn)，聯(lián)合研制出快速、準確、特異性強、靈敏度高、費用低、環(huán)境友好的藥物殘留監(jiān)測和現(xiàn)場檢測技術(shù)將成為可能。