秦楨　李愛賢　侯夫云　董順旭　王慶美

摘要：甘薯淀粉含量高，是一種重要的糧食作物和工業(yè)原料。然而，甘薯貯藏根發(fā)育過(guò)程中淀粉代謝途徑相關(guān)基因晝夜周期變化規(guī)律尚不完全清楚。為探討甘薯貯藏根發(fā)育過(guò)程中淀粉代謝相關(guān)基因晝夜周期變化規(guī)律，本研究以4個(gè)不同淀粉含量的甘薯品種為試驗(yàn)材料，采用qRT-PCR法對(duì)淀粉代謝相關(guān)基因全天的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明：IbAGPa、IbSS、IbGBSSⅠ、IbSBEⅠ、IbSBEⅡ、Ibα-amylase基因的表達(dá)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。淀粉合成相關(guān)基因（IbAGPa、IbSS、IbGBSSⅠ、IbSBEⅠ、IbSBEⅡ）的表達(dá)高峰出現(xiàn)在12時(shí)到15時(shí)，淀粉降解相關(guān)基因（Ibα-amylase）的表達(dá)高峰出現(xiàn)在15時(shí)之后。在不同淀粉含量的甘薯品種中，淀粉代謝相關(guān)基因的表達(dá)在整個(gè)晝夜周期內(nèi)都發(fā)生周期性的變化，且表達(dá)趨勢(shì)相似。本研究進(jìn)一步豐富了我們對(duì)甘薯貯藏根淀粉代謝調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

關(guān)鍵詞：甘薯;貯藏根;淀粉代謝相關(guān)基因;qRT-PCR;晝夜周期變化

中圖分類號(hào)：S531：S786文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）11-0008-05

Expression of Starch Metabolism Related

Genes in Storage Roots of Sweet Potato

Qin Zhen， Li Aixian*， Hou Fuyun， Dong Shuxu， Wang Qingmei

（Crop Research Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Scientific Observing and

Experimental Station of Tuber and Root Crops in Huang-Huai-Hai Region， Ministry of Agriculture， Jinan 250100， China）

Abstract Sweet potato is an important food crop and industrial raw material because of its high starch content. In order to explore the diurnal cycle of genes related to starch metabolism pathway in the development of storage roots of sweet potato， four cultivars with different starch content were selected as experimental materials. The expression patterns of starch metabolism related genes were analyzed by qRT-PCR. The results showed that genes of IbAGPa， IbSS， IbGBSSⅠ， IbSBEⅠ， IbSBEⅢ and Ibα-amylase had an increased expression followed by a decreasing trend. The expression peak of the genes related to starch synthesis （IbAGPa， IbSS， IbGBSSⅠ， IbSBEⅠ and IbSBEⅡ） appeared at 12 noon to 3 pm， and the expression peak of the starch degradation-related gene （Ibα-amylase） appeared after 3 pm. The results showed that the expression of starch metabolism related genes changed periodically throughout the diurnal cycle and that of the expression was similar in sweet potato cultivars with different starch contents. This study further enriched our understanding of the regulation mechanism of starch metabolism in the storage roots of sweet potato.

Keywords Sweet potato; Storage roots; Genes related to starch metabolism; qRT-PCR; Diurnal cycle change

甘薯是重要的農(nóng)作物和工業(yè)原料。甘薯薯塊中淀粉含量高，主要由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成[1]。在高等植物中，淀粉的生物合成發(fā)生在質(zhì)體中，需要一系列生物合成酶的配合，包括腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、淀粉合成酶（SS）、顆粒淀粉合成酶（GBSS）、淀粉分支酶（SBE）、淀粉去分支酶（DBE）[2]。淀粉代謝相關(guān)基因在植物中得到了廣泛的研究[3，4]。轉(zhuǎn)基因玉米植株中ZmAGPase基因的過(guò)表達(dá)可以改善玉米的籽粒性狀[5];在馬鈴薯[6]和劍蘭[7]塊莖中，通過(guò)RNAi技術(shù)完全抑制AGPase基因的表達(dá)，可以使淀粉不能形成。利用RNAi技術(shù)抑制IbGBSSI基因表達(dá)，可產(chǎn)生無(wú)直鏈淀粉轉(zhuǎn)基因甘薯[8]。通過(guò)調(diào)控甘薯中IbGBSS基因的表達(dá)，可以得到直鏈淀粉-支鏈淀粉比例不同的淀粉[9]。Miao等從香蕉果實(shí)中克隆了6個(gè)MaGBSS基因，它們分別在不同發(fā)育階段對(duì)淀粉積累起促進(jìn)作用[10]。Chen等發(fā)現(xiàn)CmSBEs基因表達(dá)量在板栗子葉發(fā)育過(guò)程中顯著增加，且淀粉總量的增加主要是支鏈淀粉的合成[11]。馬鈴薯塊莖中淀粉分支酶Ⅱ（StSBEⅡ）的過(guò)表達(dá)可增加支鏈淀粉的短鏈分支[12]。Schwall等通過(guò)RNAi技術(shù)同時(shí)抑制StSBEⅠ和StSBEⅡ基因的表達(dá)，成功地開發(fā)了一種生產(chǎn)直鏈淀粉含量高的淀粉的方法[13]。

植物中淀粉的生物合成和降解受到多重調(diào)控。Smith利用基因芯片技術(shù)分析了擬南芥葉片全天的轉(zhuǎn)錄組，表明淀粉代謝相關(guān)基因的表達(dá)受到晝夜周期的影響[14]。基因表達(dá)分析顯示，籽粒莧AcSS基因在種子成熟過(guò)程中呈現(xiàn)組成型表達(dá)[15]。在擬南芥葉片中，AtGBSSⅠ基因表達(dá)受Myb型轉(zhuǎn)錄因子CCA1和LHY的調(diào)控，在晝夜周期中呈現(xiàn)節(jié)律振蕩[16]。然而，關(guān)于甘薯貯藏根中淀粉代謝相關(guān)基因晝夜周期變化規(guī)律的研究尚未見報(bào)道。因此，我們選擇4個(gè)淀粉含量不同的甘薯品種，研究淀粉代謝相關(guān)基因的晝夜周期變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選用4個(gè)甘薯品種（濟(jì)薯25，淀粉含量22.6%;漯徐薯8號(hào)，淀粉含量為25.2%;鄭薯20，淀粉含量12.6%;紅香蕉，淀粉含量13.5%），在山東省泰安市山東果樹研究所金牛山實(shí)驗(yàn)站栽培。幼苗移栽后第106 d為貯藏根膨大階段，每3 h（6時(shí)至21時(shí)）收集發(fā)育的貯藏根。對(duì)每個(gè)品種從10個(gè)甘薯貯藏根中選擇中間大小的3個(gè)樣品，以減少取樣誤差。甘薯貯藏根用蒸餾水沖洗，切成小塊（直徑0.5 cm），冷凍于液氮中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取

用天根生化科技有限公司的多糖多酚RNA提取試劑盒，按照說(shuō)明書操作，提取RNA。

1.3 qRT-PCR驗(yàn)證

用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR引物（表1）。用羅氏LightCycler? 480II儀器進(jìn)行定量分析。定量PCR分析程序?yàn)?5℃變性15 s;然后是95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。用IbActin作為內(nèi)參基因。用2-ΔΔCT對(duì)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 IbAGPα和IbAGPβ基因的表達(dá)分析

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）催化葡萄糖-1-磷酸和ATP生成腺苷二磷酸葡萄糖，是高等植物淀粉生物合成的前體。AGPase是由兩個(gè)大亞基和兩個(gè)小亞基構(gòu)成的異源四聚體，大亞基是酶的調(diào)節(jié)中心，小亞基是酶的催化中心。本研究發(fā)現(xiàn)，4個(gè)甘薯品種貯藏根中IbAGPase大亞基（IbAGPα）的表達(dá)在晝夜周期中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在12時(shí)至15時(shí)達(dá)到表達(dá)的高峰（圖1A）。IbAGPase小亞基（IbAGPβ）在晝夜周期中表達(dá)量變化不明顯（圖1B）。Smith在擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)AtAGPase大亞基在晝夜周期中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)[14]，這與我們的研究結(jié)果一致;擬南芥葉片AtAGPase小亞基的轉(zhuǎn)錄水平也呈現(xiàn)周期變化不明顯的趨勢(shì)，然而，其表達(dá)量明顯低于甘薯。

2.2 IbSS和IbGBSSⅠ基因的表達(dá)分析

在高等植物中，有兩種不同功能和定位的淀粉合成酶：淀粉合酶（SS）和顆粒結(jié)合淀粉合酶（GBSS）。淀粉合酶主要存在于質(zhì)體基質(zhì)中，在支鏈淀粉的合成中起作用。顆粒結(jié)合淀粉合酶與淀粉顆粒緊密結(jié)合，負(fù)責(zé)直鏈淀粉的合成。顆粒結(jié)合淀粉合酶Ⅰ（GBSSⅠ）是將葡萄糖基從腺苷二磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移到葡聚糖生成直鏈淀粉的關(guān)鍵酶之一[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，四個(gè)甘薯品種貯藏根中IbSS和IbGBSSⅠ基因的表達(dá)在晝夜周期中呈周期性變化。從6時(shí)到12時(shí)，IbSS基因的表達(dá)逐漸升高，并在中午12時(shí)達(dá)到高峰。然后，從12時(shí)到21時(shí)，IbSS基因的表達(dá)逐漸降低（圖2A）。IbGBSSⅠ基因與IbSS基因呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)（圖2B）。且IbGBSSⅠ基因表達(dá)量的增幅明顯低于IbSS基因。Smith等發(fā)現(xiàn)擬南芥葉片AtSS和AtGBSS基因的表達(dá)在白天先升高后降低[14]。我們的結(jié)果中也觀察到同樣的趨勢(shì)，但是IbSS基因的上調(diào)相對(duì)于擬南芥發(fā)生在較晚的階段。這可能與光合產(chǎn)物從葉子到根的運(yùn)輸有關(guān)。AtGBSS基因的上調(diào)表達(dá)高于AtSS基因，這與我們的結(jié)果相反。這可能因?yàn)檫@兩種植物的淀粉成分不同有關(guān)。Zeeman發(fā)現(xiàn)擬南芥淀粉含量的增加與葉片直鏈淀粉含量的增加有關(guān)[18]，而甘薯貯藏根淀粉的主要成分是支鏈淀粉[19]。

2.3 IbSBEⅠ和IbSBEⅡ基因的表達(dá)分析

淀粉分支酶（SBE）是淀粉生物合成的關(guān)鍵酶，通過(guò)在葡聚糖上產(chǎn)生α-1，6-糖苷鍵從而產(chǎn)生分支。IbSBEⅠ基因在甘薯塊根中有較強(qiáng)的表達(dá)，其在甘薯發(fā)育的貯藏根的淀粉合成中起著重要作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，IbSBEⅠ和IbSBEⅡ在4個(gè)甘薯品種發(fā)育的貯藏根中的表達(dá)在整個(gè)晝夜周期中呈周期性變化。從6時(shí)到15時(shí)，IbSBEⅠ基因的表達(dá)逐漸升高，并在15時(shí)達(dá)到高峰，然后，從15時(shí)到21時(shí)，IbSBEⅠ基因的表達(dá)逐漸降低（圖3A）。IbSBE Ⅱ基因與IbSBE Ⅰ基因表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)（圖3B）。但I(xiàn)bSBE Ⅱ基因的上調(diào)幅度明顯高于IbSBE Ⅰ基因。我們的結(jié)果表明，IbSBE Ⅰ和IbSBE Ⅱ基因的表達(dá)在整個(gè)晝夜循環(huán)中呈先升高后降低的趨勢(shì)，這與Smith等[14]的研究結(jié)果一致。

2.4 Ibα-amylase和Ibβ-amylase基因的表達(dá)分析

淀粉的水解依賴α-淀粉酶（α-amylase）、β-淀粉酶（β-amylase）、去分支酶和α-葡萄糖苷酶的共同作用。α-淀粉酶直接攻擊淀粉粒，水解釋放可溶性亞基，然后在其他三個(gè)酶的作用下水解成麥芽糖和葡萄糖[21]。β-淀粉酶催化淀粉粒非還原末端α-1，4糖苷鍵的水解，產(chǎn)生麥芽糖。本研究發(fā)現(xiàn)，Ibα-amylase基因的表達(dá)在4個(gè)甘薯品種發(fā)育的貯藏根中隨著晝夜周期呈現(xiàn)規(guī)律性變化。從6時(shí)到18時(shí)，Ibα-amylase基因的表達(dá)逐漸升高，在15時(shí)至18時(shí)達(dá)到高峰。然后，從18時(shí)到21時(shí)，Ibα-amylase基因的表達(dá)逐漸降低（圖4A）。Smith研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥葉Atα-amylase基因的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，Atα-amylase基因表達(dá)的高峰顯著早于甘薯中的結(jié)果。Ibβ-amylase基因的表達(dá)在4個(gè)甘薯品種發(fā)育的貯藏根中隨晝夜周期沒有明顯變化（圖4B）。

3 討論與結(jié)論

已有的研究表明，淀粉合成酶可在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)水平調(diào)控淀粉的合成。在植物體非光合貯藏器官中，AGPase在淀粉合成中的作用主要是通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平來(lái)調(diào)控。在小麥種子灌漿期，AGPase的含量和淀粉合成速率與AGPase基因表達(dá)水平呈正相關(guān)[22]。馬鈴薯塊莖形成時(shí)，AGPase對(duì)淀粉合成的調(diào)控主要體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上[23]。我們的研究發(fā)現(xiàn)甘薯中IbAGPα基因的表達(dá)還受到晝夜周期的調(diào)控，說(shuō)明晝夜周期是影響甘薯貯藏根淀粉合成的一個(gè)因素。GBSSⅠ酶能夠合成顆粒淀粉，在暗周期中會(huì)降解，在光照周期中會(huì)迅速合成[14]，GBSSⅠ酶的變化規(guī)律與甘薯中IbGBSSⅠ基因的表達(dá)水平一致，這表明GBSS酶活性也受到轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。SS主要在支鏈淀粉的合成中起作用，GBSS主要在直鏈淀粉合成中起作用。Ulrka等[24]研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯SBEⅠ以直鏈淀粉為底物，而SBEⅡ以支鏈淀粉為底物，我們的研究發(fā)現(xiàn)IbSS和IbSBEⅡ基因的表達(dá)在晝夜周期中上調(diào)的水平明顯高于IbGBSS和IbSBEⅠ基因，這與甘薯貯藏根淀粉的主要成分是支鏈淀粉相對(duì)應(yīng)[19]。

本研究對(duì)4個(gè)淀粉含量不同的甘薯品種發(fā)育的貯藏根中淀粉代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析顯示，其在晝夜周期中從6時(shí)到21時(shí)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)高峰出現(xiàn)在12時(shí)到15時(shí)，淀粉降解相關(guān)基因的表達(dá)高峰出現(xiàn)在15時(shí)之后，不同淀粉含量甘薯品種淀粉代謝相關(guān)基因表達(dá)趨勢(shì)相似，揭示了淀粉代謝相關(guān)基因在整個(gè)晝夜循環(huán)中的表達(dá)變化。本研究進(jìn)一步豐富了我們對(duì)甘薯貯藏根淀粉代謝調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]Himada T，Otani M，Hamada T，et al. Increase of amylose content of sweetpotato starch by RNA interference of the starch branching enzymeⅡgene （IbSBEⅡ） [J]. Plant Biotechnology，2006，23（1）：85-90.

[2]Jeon J S，Ryoo N，Hahn T R，et al. Starch biosynthesis in cereal endosperm [J]. Plant Physiol. Biochem.，2010，48（6）：383-392.

[3]劉美，張鳳，楊翠翠，等. 小麥種子萌發(fā)早期淀粉降解關(guān)鍵酶活性及基因表達(dá)量研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，46（9）：39-45.

[4]Mitsui T，Itoh K，Hori H，et al. Biosynthesis and degradation of starch [J]. Bulletin of the Faculty of Agriculture Niigata University，2009，33（4）：431-454.

[5]Li N，Zhang S，Zhao Y，et al. Over-expression of AGPase genes enhances seed weight and starch content in transgenic maize [J]. Planta，2011，233（2）：241-250.

[6]Müllerrber B，Sonnewald U，Willmitzer L. Inhibition of the ADP-glucose pyrophosphorylase in transgenic potatoes leads to sugar-storing tubers and influences tuber formation and expression of tuber storage protein genes [J]. EMBO Journal，1992，11（4）：1229-1238.

[7]Seng S S，Wu J，Sui J J，et al. ADP-glucose pyrophosphorylase gene plays a key role in the quality of corm and yield of cormels in gladiolus [J]. Biochemical & Biophysical Research Communications，2016，474（1）：206-212.

[8]Otani M，Hamada T，Katayama K，et al. Inhibition of the gene expression for granule-bound starch synthase I by RNA interference in sweet potato plants [J]. Plant Cell Rep.，2007，26（10）：1801-1807.

[9]Kimura T，Saito A. Heterogeneity of poly（A） sites in the granule-bound starch synthaseⅠgene in sweet potato （Ipomoea batatas （L.） Lam.） [J]. Biosci. Biotechnol. Biochem.，2010，74（3）：667-669.

[10]Miao H，Sun P，Liu W，et al. Identification of genes encoding granule-bound starch synthase involved in amylose metabolism in banana fruit[J]. PLoS ONE，2014，9（2）：e88077.

[11]Chen L，Lu D，Wang T，et al. Identification and expression analysis of starch branching enzymes involved in starch synthesis during the development of chestnut （Castanea mollissima Blume） cotyledons [J]. PLoS ONE，2017，12（5）：e0177792.

[12]Brummell D A，Watson L M，Zhou J，et al. Overexpression of STARCH BRANCHING ENZYMEⅡincreases short-chain branching of amylopectin and alters the physicochemical properties of starch from potato tuber [J]. BMC Biotechnology，2015，15（1）：28.

[13]Schwall G P，Safford R，Westcott R J，et al. Production of very-high-amylose potato starch by inhibition of SBE A and B [J]. Nature Biotechnology，2000，18（5）：551-554.

[14]Smith S M，F(xiàn)ulton D C，Chia T，et al. Diurnal changes in the transcriptome encoding enzymes of starch metabolism provide evidence for both transcriptional and posttranscriptional regulation of starch metabolism in Arabidopsis leaves [J]. Plant Physiology，2004，136（1）：2687-2699.

[15]Park Y J，Nishikawa T，Tomooka N，et al. Molecular cloning and expression analysis of a gene encoding soluble starch synthaseⅠfrom grain amaranth （Amaranthus cruentus L.） [J]. Molecular Breeding，2012，30（2）：1065-1076.

[16]Tenorio G，Orea A，Romero J M，et al. Oscillation of mRNA level and activity of granule-bound starch synthaseⅠin Arabidopsis leaves during the day/night cycle [J]. Plant Mol. Biol.，2003，51（6）：949-958.

[17]Zeeman S C，Kossmann J，Smith A M. Starch： its metabolism，evolution and biotechnological modification in plants [J]. Annual Review of Plant Biology，2010，61（1）：209-234.

[18]Zeeman S C，Tiessen A，Pilling E，et al. Starch synthesis in Arabidopsis： granule synthesis，composition and structure [J]. Plant Physiology，2002，129（2）：516.

[19]史春余，姚海蘭，張立明，等. 不同類型甘薯品種塊根淀粉粒粒度的分布特征[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（21）：4537-4543.

[20]Hamada T，Kim S H，Shimada T. Starch-branching enzyme I gene （IbSBEI） from sweet potato （Ipomoea batatas）， molecular cloning and expression analysis [J]. Biotechnology Letters，2006，28（16）：1255-1261.

[21]Sarikaya E，Higasa T，Adachi M，et al. Comparison of degradation abilities of α- and β-amylases on raw starch granules [J]. Process Biochemistry，2000，35（7）：711-715.

[22]Anderson J M， Larsen R， Laudencia D， et al. Molecular characterization of the gene encoding a rice endosperm-specific ADP-glucose pyrophosphorylase subunit and its developmental pattern of transcription [J]. Gene，1991，97（2）：199-205.

[23]Smith-White B J， Preiss J. Comparison of proteins of ADP-glucose pyrophosphorylase from diverse sources [J]. J. Mol. Evol.，1992，34（5）：449-464.

[24]Ulrka R， Lena A， Roger A. Comparion of starch branching enzyme Ⅲ from potato [J]. European Journal of Biochemistry，2001，268：6140-6145.

收稿日期：2019-08-13

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFD1000705-8）;國(guó)家甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-10-B07）;山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系薯類創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（SDAIT-16-04）;山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所學(xué)科團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（CXGC2018E01）

作者簡(jiǎn)介：秦楨（1979—），男，助理研究員，博士，主要從事甘薯分子育種工作。E-mail：qinzhenbio@163.com

*同為第一作者。

通訊作者：王慶美（1964—），女，研究員，博士，主要從事甘薯育種工作。E-mail：wang-qm@163.com