于金慧　劉云鵬　徐貴祎　馬德源　烏日娜　武俊瑞　黃超　張娟　尤升波　畢玉平

摘要：為篩選既有優(yōu)良果蔬發(fā)酵特性又有利于人體腸道微生態(tài)平衡的功能性果蔬發(fā)酵專用益生菌，本研究以新鮮鮑芹根為試材，結(jié)合傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)方法對(duì)其根際分離得到的乳酸菌進(jìn)行鑒定，對(duì)篩選出產(chǎn)酸能力強(qiáng)、生長旺盛的菌株進(jìn)行耐受性和抗氧化能力評(píng)價(jià)。經(jīng)鑒定，分離得到的兩株乳酸菌分別為植物乳桿菌（產(chǎn)酸能力強(qiáng)、生長旺盛）和戊糖片球菌。對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行人工模擬耐受性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，該菌在pH值為2.5、3.5、4.5的人工胃液中處理3 h后菌量仍保持在106 CFU/mL以上;人工腸液培養(yǎng)2、3 h的存活率分別為155.9%、191.9%，4 h后菌種數(shù)量開始下降，存活率仍為35.7%;隨鹽濃度增加，該菌的存活率下降，但7.5 mg/mL的膽鹽溶液和70 mg/mL鈉鹽溶液中菌量仍能維持在106 CFU/mL以上。抗氧化能力試驗(yàn)表明，該菌發(fā)酵上清液的DPPH自由基清除率可達(dá)91.8%，固形物醇提液的亞鐵離子螯合能力比發(fā)酵上清液的高出13.7個(gè)百分點(diǎn)。綜上，植物乳桿菌具有較好的耐受性和抗氧化能力，后期可用于益生菌相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)。

關(guān)鍵詞：鮑芹;乳酸菌;植物乳桿菌;分離純化;鑒定;耐受性;抗氧化能力

中圖分類號(hào)：S636.3：TS201.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）11-0074-07

Screening and Evaluation of Tolerance and Antioxidant

Capacity of Lactobacillus in Baoqin Rhizosphere

Yu Jinhui1， Liu Yunpeng1，2， Xu Guiyi3， Ma Deyuan1， Wu Rina4， Wu Junrui4，

Huang Chao1， Zhang Juan5， You Shengbo1， Bi Yuping1

（1. Biotechnology Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China;

2. College of Life Sciences， Shandong Normal University， Jinan 250014， China;

3. School of Medicine and Life Sciences， University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences， Jinan 250200， China;

4. College of Food Science， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China;

5. Shandong Institute for Product Quality Supervision and Inspection， Jinan 250100， China）

Abstract In order to screen out the special probiotics for functional fruit and vegetable fermentation， which not only have excellent fermentation characteristics， but also are benefit to the intestinal microecological balance of human body， the fresh Baoqin roots were used as the test material in this study， and the acid-producing bacteria isolated from its rhizosphere were identified by traditional methods and molecular biological methods， and the strains with strong acid production ability and vigorous growth were screened out for tolerance and antioxidant ability evaluation. The two bacteria were identified as Lactobacillus plantans and Gluconococcus glutinosa. The tolerance test showed that the amount of Lactobacillus plantatus remained above 106 CFU/mL treated in simulated gastric fluid with pH value as 2.5， 3.5 and 4.5 respectively after 3 hours. The survival rate of simulated intestinal fluid cultured for 2 hours and 3 hours was 155.9% and 191.9%， respectively. After 4 hours， the number of bacteria began to decline and the survival rate was still 35.7%. With the increase of salt concentration， the survival rate of bacteria decreased， but the bacteria content in 7.5 mg/mL bile salt solution and 70 mg/mL sodium salt solution could still maintain above 106 CFU/mL. The antioxidant evaluation results showed that the DPPH radical scavenging rate of the fermentation supernatant could reach 91.8%， and the chelating ability of ferrous ions in the thallus alcohol extract was 13.7 percentage points higher than that in the fermentation supernatant. In conclusion， the isolated strain had better tolerance and antioxidant ability， which could be used for the research and development of probiotics related products.

Keywords Baoqin; Lactic acid bacteria; Lactobacillus plantarum; Separation and purification; Identification; Tolerance; Antioxidant capacity

益生菌是指通過攝取適當(dāng)?shù)牧繉?duì)食用者身體健康能發(fā)揮有效作用的活菌，具有促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、改善腸道功能、降低三高、提高免疫力、抗腫瘤等功效[1-4]，是當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。我國衛(wèi)健委規(guī)定的可用于保健食品和功能食品的益生菌菌種名單中絕大多數(shù)為乳酸菌類，而乳酸菌也是目前商業(yè)化應(yīng)用的主要益生菌。自然界中發(fā)現(xiàn)并分離的乳酸菌種屬近30個(gè)，其中較大的乳酸菌種屬有乳桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、片球菌屬等[5]。

益生菌發(fā)酵果蔬產(chǎn)品將益生菌與果蔬原料相結(jié)合，具有二者的雙重優(yōu)勢(shì)，無論在研究還是應(yīng)用方面均取得較好的成效[6，7]。然而，南昌大學(xué)的謝明勇[8]指出用于果蔬發(fā)酵的乳酸菌多為牛奶發(fā)酵菌株，較少采用植物乳桿菌等植物來源乳酸菌。由于牛奶發(fā)酵菌株利用果蔬產(chǎn)酸的能力有限且耐酸性較差，難以有效地發(fā)酵果蔬原料使之產(chǎn)生良好的風(fēng)味和營養(yǎng)物質(zhì)，致使現(xiàn)有乳酸菌發(fā)酵果蔬產(chǎn)品風(fēng)味不夠純正。因此，篩選既有優(yōu)良果蔬發(fā)酵特性又有利于人體腸道微生態(tài)平衡的功能性果蔬發(fā)酵專用益生菌株勢(shì)在必行。

本研究擬從新鮮鮑芹根際分離乳酸菌，并進(jìn)行純化、鑒定和分析，篩選產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的菌株，再通過人工模擬胃腸道環(huán)境對(duì)其進(jìn)行耐受性和抗氧化能力評(píng)價(jià)，以期為該菌株的生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮鮑菜根，采自濟(jì)南市章丘區(qū)鮑家村。

1.2 主要試劑

葡萄糖、檸檬酸氫二胺、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳、無水硫酸鈉、亞硝酸鈉、三氯化鋁、鉬酸銨、乙酸鈉等均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;瓊脂粉，購自北京索萊寶科技有限公司;蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司;牛膽鹽、胃蛋白酶（1∶12 000）、胰蛋白酶（1∶250），購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基配制

LB培養(yǎng)基：蛋白胨6.0 g，酵母浸粉5.0 g，氯化鈉10.0 g，蒸餾水定容至1 L。高壓滅菌鍋115℃滅菌20 min。

MRS培養(yǎng)基：牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，葡萄糖20.0 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，蛋白胨10.0 g，固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉18 g，蒸餾水定容至1 L，高壓滅菌鍋115℃滅菌20 min。

含膽鹽MRS培養(yǎng)基：分別添加0.00、0.06、0.20、0.40、0.60、1.00、1.50 g的牛膽鹽于200 mL MRS液體培養(yǎng)基，使其質(zhì)量濃度分別為 0、0.3、1.0、3.0、5.0、7.5 mg/mL，115℃高壓蒸汽滅菌20 min。

含高鹽MRS培養(yǎng)基：分別添加0、2、4、6、8、10、12、14 g的氯化鈉于200 mL MRS液體培養(yǎng)基中，使其質(zhì)量濃度分別為 0、10、20、30、40、50、60、70 mg/mL，115℃高壓蒸汽滅菌20 min。

人工胃液：量取一定體積的濃鹽酸，蒸餾水稀釋，將pH值分別調(diào)至1.5、2.5、3.5、4.5。分別加入胃蛋白酶將濃度調(diào)至10 mg/mL，使用0.22 μm濾膜過濾除菌備用。

人工腸液：將3.4 g磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）充分溶于250 mL蒸餾水中，用0.4 g/mL NaOH溶液調(diào)至pH= 6.8，稀釋至500 mL后加入胰蛋白酶，使胰蛋白酶溶液濃度為10 mg/mL，充分溶解后使用0.22 μm濾膜過濾除菌備用。

1.4 菌株的分離純化與鑒定

將未經(jīng)清洗的新鮮鮑芹根切成小塊，放入三角瓶（已滅菌且含有鋼珠）中，加無菌水100 mL，200 r/min振搖30 min。于超凈工作臺(tái)將上述溶液分別稀釋103、104、105、106倍，取100 μL涂布于MRS平板。37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后挑取表面光滑的單一菌落，劃線法純化培養(yǎng)3代后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

采用革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗(yàn)[9]對(duì)菌株進(jìn)行初步判斷，后用乳酸菌通用引物（A27F：5′-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3′;A1495R：5′-GACTCGGTCCTAGTTTGAGAAGCACTGAGGCTCTTGAGACG-3′）進(jìn)行16S rDNA驗(yàn)證。具體檢測(cè)和比對(duì)工作委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.5 菌株的耐受性分析

1.5.1 對(duì)人工胃液的耐受性 取二次活化的菌種，3 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，用無菌水重懸。接種至不同pH值（1.5、2.5、3.5、4.5）的人工胃液中，接種密度約為107 CFU/mL，37℃靜止培養(yǎng)0、1、2、3 h時(shí)取樣，梯度稀釋后涂布至MRS平板，37℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

1.5.2 對(duì)人工腸液的耐受性 操作步驟同1.5.1，接種至人工腸液中，并于培養(yǎng)0、1、2、3、4 h時(shí)取樣計(jì)數(shù)。

1.5.3 對(duì)膽鹽的耐受性 操作步驟同1.5.1，接種至不同膽鹽濃度的MRS液體培養(yǎng)基中，于 37℃振蕩培養(yǎng)24 h，梯度稀釋后涂布至MRS平板，37℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

1.5.4 對(duì)高鹽的耐受性 操作步驟同1.5.1，接種至不同高鹽濃度的MRS液體培養(yǎng)基中，于 37℃振蕩培養(yǎng)24 h，梯度稀釋后涂布至MRS平板，37℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

1.6 菌株的抗氧化活性

菌種上清液及醇提液制備：取經(jīng)二次接種于MRS培養(yǎng)基且生長至48 h的菌液，3 000 r/min離心5 min，取上清液4℃保存?zhèn)溆?。剩下的菌體沉淀于45℃烘至恒重，研缽中研磨粉碎，過60目篩，稱取0.40 g菌粉，加入70%乙醇20 mL浸提12 h，超聲提取1 h，3 000 r/min離心5 min，所得上清液為醇提液（20 mg/mL），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DPPH自由基清除能力[10]：分別取菌種上清液和菌體醇提液各1 mL置于不同的 10 mL螺紋試管，再加入0.008 mmol/L DPPH溶液3.0 mL，室溫下暗反應(yīng)30 min，以無水乙醇為空白對(duì)照標(biāo)零，于517 nm處測(cè)定吸光度值。計(jì)算公式：

DPPH自由基清除率（%）=[A₀-（A_s-A_c）/A₀]×100 。

式中，A0：蒸餾水1.0 mL+DPPH溶液3.0 mL的吸光度;As：樣品溶液1.0 mL+DPPH溶液3.0 mL的吸光度;Ac：樣品溶液1.0 mL+無水乙醇3.0 mL的吸光度。

亞鐵離子螯合能力[10]：各取菌種上清液和菌體醇提液1 mL分別于3.7 mL蒸餾水混合均勻，后加入2 mmol/L的FeCl2樣品0.1 mL、5 mmol/L的菲洛嗪溶液0.2 mL，25℃水浴反應(yīng)10 min，562 nm處測(cè)定吸光度值，以EDTA-Na2作為陽性對(duì)照。計(jì)算公式：

Fe²⁺螯合率=1-（A₁-A₂）/A₀×100% 。

式中，A0：1 mL蒸餾水代替樣品溶液后的吸光度;A1：樣品溶液反應(yīng)后的吸光度;A2：0.1 mL的蒸餾水代替FeCl2溶液后的吸光度。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（Oneway-ANOVA）和Duncans多重比較分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離與鑒定

2.1.1 菌種分離 從涂布MRS平板中選取溶鈣圈較大、表面光滑且呈乳白色的菌落，通過平板劃線分離法反復(fù)進(jìn)行劃線分離純化（圖1），得到分離菌種1和2。

2.1.2 菌種鑒定 革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗(yàn)證實(shí)（圖2），兩株菌均為革蘭氏陽性菌，過氧化氫酶陰性。通過16S rDNA擴(kuò)增，并在NCBI中進(jìn)行Blast序列比對(duì)，明確1株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），命名為Lactobacillus plantarum BQG，1株為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），命名為Pediococcus pentosaceus BQG。其中L. plantarum BQG的生長速度快、活力旺盛，相同條件下產(chǎn)酸較多，因此對(duì)該菌株進(jìn)行耐受性評(píng)價(jià)，以期用于益生菌產(chǎn)品開發(fā)。

2.2 乳酸菌的耐受性評(píng)價(jià)

2.2.1 對(duì)人工胃液的耐受性 由圖3可以看出，人工胃液pH值分別為2.5、3.5、4.5時(shí)，L. plantarum BQG的存活率較高，菌量均高于106 CFU/mL。其中，培養(yǎng)1 h的L. plantarum BQG數(shù)量在pH=4.5和pH=3.5的環(huán)境下有所增加，相對(duì)接種0 h增幅分別為108.4%和124.1%;2 h時(shí)，菌量開始下降，pH=4.5和pH=3.5時(shí)的存活率分別為76.8%和76.0%;培養(yǎng)3 h后，L. plantarum BQG在pH=2.5的環(huán)境下仍能保持11.0%的存活率。然而，當(dāng)人工胃液pH值為1.5時(shí)，菌種數(shù)量在0～2 h內(nèi)直線下降，2 h以上則全部死亡，說明該菌不適宜在強(qiáng)酸環(huán)境下生存。

2.2.2 對(duì)人工腸液的耐受性 由圖4可知，人工腸液中培養(yǎng)1～3 h時(shí)，隨時(shí)間的延長，植物乳桿菌數(shù)量逐漸增加，培養(yǎng)3 h的存活率高達(dá)191.9%;4 h后，菌種數(shù)量開始下降，存活率降至35.7%，但菌種數(shù)量仍維持在107 CFU/mL左右。表明該菌具備較強(qiáng)的腸液耐受性。

2.2.3 對(duì)膽鹽的耐受性 由圖5可以看出，植物乳桿菌在0.3 mg/mL的膽鹽濃度下存活率為89.2%，在1.0 mg/mL時(shí)則下降至22.7%，大于3.0 mg/mL時(shí)，菌株的存活率維持在5.0%左右。隨著膽鹽濃度的升高，該菌數(shù)量整體先呈下降趨勢(shì)，后趨于平穩(wěn)，菌量保持在106 CFU/mL以上。說明該菌的耐膽鹽能力較好。

2.2.4 對(duì)高鹽的耐受性 由圖6可以看出，當(dāng)鹽濃度為10、20 mg/mL時(shí)，植物乳桿菌的存活率分別為121.1%、114.9%，說明一定濃度的鈉鹽對(duì)該菌的生長具有促進(jìn)作用;當(dāng)鹽濃度超過50 mg/mL時(shí)，該菌的存活率下降幅度較大，至鹽濃度為70 mg/mL時(shí)，存活率僅為3.0%。該菌數(shù)量在0～40 mg/mL鹽濃度范圍內(nèi)雖整體呈下降趨勢(shì)，但變化不大，菌落數(shù)量均維持在107 CFU/mL以上，至鹽濃度為70 mg/mL時(shí)，菌量也高于106 CFU/mL。

2.3 乳酸菌的抗氧化作用評(píng)價(jià)

由圖7可以看出，植物乳桿菌的發(fā)酵上清液與固形物醇提液都有一定的抗氧化能力。其中，發(fā)酵上清液的DPPH自由基清除能力較強(qiáng)，清除率可以達(dá)到91.8%;而固形物醇提液的亞鐵離子螯合率比發(fā)酵上清液的高出13.7個(gè)百分點(diǎn)。

3 討論與結(jié)論

目前，益生菌廣泛應(yīng)用于醫(yī)療健康、食品工業(yè)、動(dòng)物健康養(yǎng)殖和農(nóng)業(yè)種植等領(lǐng)域，而我國益生菌產(chǎn)業(yè)最核心的菌株資源長期依賴進(jìn)口。近年來，我國學(xué)者在篩選具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的菌種方面取得很大進(jìn)步，如內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)張和平團(tuán)隊(duì)已建成我國最大的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的乳酸菌菌種資源庫。但是益生菌最大的應(yīng)用領(lǐng)域?yàn)槿橹破?，果蔬發(fā)酵專用益生菌的種類較少[11]，難以保證人體對(duì)果蔬發(fā)酵制品風(fēng)味和營養(yǎng)的需求[12]。因此，篩選果蔬發(fā)酵專用優(yōu)良菌株并建立相應(yīng)的資源庫對(duì)于農(nóng)產(chǎn)品的高附加值開發(fā)利用具有重要意義。

本試驗(yàn)從鮑芹根際分離得到兩株產(chǎn)酸菌，經(jīng)鑒定，分別為植物乳桿菌（L. plantarum BQG）和戊糖片球菌（P. pentosaceus BQG），其中L. plantarum BQG具有較好的產(chǎn)酸和繁殖能力。對(duì)其進(jìn)行耐受性評(píng)價(jià)后發(fā)現(xiàn)，該菌在pH值為2.5、3.5、4.5的人工胃液中處理3 h后數(shù)量仍保持在106 CFU/mL以上。一般情況下，空腹?fàn)顟B(tài)胃酸pH值在0.9～1.8，而進(jìn)食后pH值會(huì)上升至3左右[12]。因此，該菌株具備一定的耐受胃中酸性環(huán)境的能力，若開發(fā)該菌作為商品化益生菌菌劑則適合在餐后服用。腸液環(huán)境復(fù)雜，對(duì)菌群的生長繁殖影響較大，因此，益生菌的腸液耐受性強(qiáng)弱決定了其能否在腸液中存活，而一定數(shù)量的活菌是發(fā)揮益生功能的關(guān)鍵。L. plantarum BQG在人工腸液培養(yǎng)2、3 h的存活率分別為155.9%和191.9%，4 h后該菌數(shù)量開始下降，存活率仍達(dá)35.7%，說明該菌具有很強(qiáng)的腸液耐受性。此外，判斷該菌株能否在腸道中生存繁殖，還要評(píng)價(jià)其耐高鹽能力。肝臟分泌出的膽汁酸與甘氨酸或者?；撬岚l(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成的膽鹽會(huì)隨著膽汁進(jìn)入小腸內(nèi)，發(fā)生膽鹽的腸-肝循環(huán)[13]，在這一過程中，部分膽鹽留存于腸道內(nèi)會(huì)影響益生菌活力。較高的腸道離子濃度會(huì)造成腸道微生物發(fā)生質(zhì)壁分離，菌株失水死亡。而離子濃度過低時(shí)，某些無細(xì)胞壁的菌株會(huì)發(fā)生溶脹現(xiàn)象，細(xì)胞破裂死亡[14]。人體胃腸道中膽鹽濃度質(zhì)量約為3 mg/mL，NaCl的質(zhì)量濃度約在10～40 mg/mL范圍內(nèi)[12]，L. plantarum BQG在7.5 mg/mL的膽鹽溶液和70 mg/mL鈉鹽溶液中菌量均能維持在106 CFU/mL以上，說明該菌具有較強(qiáng)的耐膽鹽和耐高鹽特性。抗氧化能力試驗(yàn)表明，該菌發(fā)酵上清液的DPPH自由基清除率可達(dá)91.8%，固形物醇提液的亞鐵離子螯合率比發(fā)酵上清液的高出13.7個(gè)百分點(diǎn)。

綜合分析可知，本次試驗(yàn)分離得到的植物乳桿菌具有較強(qiáng)的體外環(huán)境耐受能力，還具有較高的抗氧化活性，后期可用于益生菌相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)。此外，后續(xù)試驗(yàn)還需深入研究該菌的益生功能，并對(duì)其發(fā)酵的果蔬制品進(jìn)行風(fēng)味和營養(yǎng)評(píng)價(jià)，以期為該菌的生產(chǎn)應(yīng)用提供依據(jù)。

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收稿日期：2019-06-21

基金項(xiàng)目：山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng) （SDAIT-26-09）;山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大科技成果培育項(xiàng)目（2015CGPY07）;山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2012GNC11016）;山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金項(xiàng)目（2015YQN32）;國家國際科技合作專項(xiàng)（2012DFA30450）

作者簡介：于金慧（1985—），女，山東濟(jì)寧人，博士，助理研究員，主要從事微生物資源利用、功能性成分及其生物活性研究。E-mail：faith_2002@163.com

通訊作者：尤升波（1973—），男，山東臨沂人，碩士，研究員，主要從事微生物資源利用及乳酸菌功能飲品研發(fā)。E-mail：18663700369@126.com

畢玉平（1961—），男，山東青州人，博士，研究員，主要從事微藻培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物積累及活性研究。E-mail：yupingbi@vip.sina.com