趙俊英

(隴東學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，甘肅 慶陽(yáng) 745000)

目前磷作為食品中的一種常量元素，主要以核蛋白、磷蛋白、磷酯等有機(jī)態(tài)存在[1]。磷對(duì)生命體有著不可低估的作用，因此準(zhǔn)確測(cè)定蔬菜中磷的含量和存在形式顯得尤為重要。常見(jiàn)的測(cè)定磷含量的方法有鉬藍(lán)比色法[2]、釩鉬黃比色法[3]、氣相色譜法[4]、原子吸收光譜法[5]、生化分析儀法[6]等測(cè)定樣品中磷的含量。與鉬藍(lán)比色法相比，釩鉬黃比色法適用范圍較廣，但精密度差；氣相色譜法主要用于有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。相比而言，大多數(shù)方法需要進(jìn)行繁瑣的樣品前處理，耗時(shí)間，且儀器價(jià)格昂貴，需專(zhuān)業(yè)人員維護(hù)，成本過(guò)高，不適用于普通的實(shí)驗(yàn)測(cè)定。而鉬藍(lán)分光光度法可以彌補(bǔ)上述方法的缺點(diǎn)，是一種成本低、快速、簡(jiǎn)單、可用于簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)的分析方法。

實(shí)驗(yàn)室一般采用微波消解[7]、濕法消解[8]和干法消解[9]進(jìn)行樣品前處理，微波消解需要的實(shí)驗(yàn)設(shè)備較昂貴，而干法消解耗時(shí)較長(zhǎng)，用量大且易損失；濕法消解用量少、操作簡(jiǎn)便，在短時(shí)間內(nèi)就能消解完全，因此本文選擇濕法消解進(jìn)行樣品前處理，使有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為磷酸鹽形式。然后在酸性條件下，使之與鉬酸銨反應(yīng)生成磷鉬酸銨，被還原劑還原成亮藍(lán)色的配合物-鉬藍(lán)的原理，測(cè)定其吸光度，進(jìn)而測(cè)定試樣中磷的含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

721型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)、菠菜(市售)、鉬酸銨(AR)、對(duì)苯二酚(AR)、亞硫酸鈉(AR)、磷酸二氫鉀(AR)、濃硫酸、濃硝酸、30%H2O2。

1.2 樣品處理及試劑配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g的菠菜樣品于150 mL錐形瓶中，分別加入5 mL的濃硝酸和濃硫酸，加熱至冒煙，然后待冷卻后加入5 mL 30%H2O2，繼續(xù)緩慢加熱，重復(fù)以上的步驟直至瓶?jī)?nèi)不再冒煙，溶液呈無(wú)色透明或淡黃色，冷卻后加入5 mL的硝酸(1∶1)溶液，加熱使酸徹底分解，用蒸餾水稀釋至50 mL的容量瓶中待測(cè)，用同樣的方法制備空白溶液。

磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：精確稱(chēng)取在105℃下干燥后的磷酸二氫鉀0.4394 g用水溶解并稀釋至100 mL，此溶液每毫升含磷1000 μg。

磷標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：用移液管準(zhǔn)確移取10.00 mL磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液至100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻，此溶液磷的濃度是100.0 μg·mL-1；再用移液管準(zhǔn)確移取100.0 μg·mL-1磷標(biāo)準(zhǔn)溶液10.00 mL至100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度混勻，此溶液磷的濃度為10.00 μg·mL-1，相當(dāng)于0.01 mg·mL-1[10]。

2 結(jié)果與討論

2.1 波長(zhǎng)的確定

準(zhǔn)確吸取磷標(biāo)準(zhǔn)使用液0.00、1.00 mL分別置于25 mL的比色管中。依次加入2.00 mL的鉬酸銨(50 g·L-1)，搖勻，靜置幾秒后，分別加入1.00 mL亞硫酸鈉(20 g·L-1)和1.00 mL的對(duì)苯二酚(5 g·L-1)，加水至刻度搖勻，從波長(zhǎng)630 nm處開(kāi)始，隔10 nm測(cè)一次數(shù)據(jù)，見(jiàn)表1。以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱橫坐標(biāo)作圖，見(jiàn)圖1。

表1 不同波長(zhǎng)下的吸光度

圖1 波長(zhǎng)與吸光度的關(guān)系

由圖1可知，隨著波長(zhǎng)增加，吸光度逐漸增加，在波長(zhǎng)700 nm處吸光度最大，因此本文確定測(cè)定波長(zhǎng)為700 nm。

2.2 顯色溫度和顯色時(shí)間的確定

當(dāng)室溫低于15℃時(shí)，由于試樣中總磷含量濃度較低，分子間稀疏，低溫時(shí)分子運(yùn)動(dòng)緩慢，有效碰撞的概率低，使得顯色時(shí)間較長(zhǎng)[10]，因此本實(shí)驗(yàn)采取在20～30℃的水浴中加熱進(jìn)行，達(dá)到縮短顯色時(shí)間的目的。取磷標(biāo)準(zhǔn)使用液0.00、1.00 mL在水浴中分別靜置10、15、20、25、30、35 min后測(cè)定吸光度，數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，根據(jù)表2數(shù)據(jù)以顯色時(shí)間對(duì)吸光度作圖，見(jiàn)圖2。之后在相同溫度下，縮小時(shí)間的測(cè)定范圍，分別靜置20、22、24、26、28、30、32 min后測(cè)定，數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，據(jù)表3數(shù)據(jù)以顯色時(shí)間對(duì)吸光度作圖，見(jiàn)圖3。

表2 顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響

表3 顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響

圖2 顯色時(shí)間和吸光度的關(guān)系

圖3 顯色時(shí)間和吸光度的關(guān)系

由圖2和圖3可知，隨顯色時(shí)間的增加，吸光度逐漸增加，在24 min時(shí)吸光度最大，因此本文選擇在水浴中靜置24 min之后測(cè)定吸光度。

2.3 還原劑用量的確定

取十只25 mL比色管，用移液管移取磷標(biāo)準(zhǔn)液1.00 mL，加入2.00 mL鉬酸銨，靜置幾秒后，分別加入還原劑0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mL，然后加水至刻度充分搖勻，靜置24 min后以不加還原劑的空白溶液做參比，測(cè)定數(shù)據(jù)見(jiàn)表4，根據(jù)表4數(shù)據(jù)以還原劑對(duì)吸光度作圖，見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著還原劑用量的增加，吸光度逐漸增大，之后逐漸減小，在1.80 mL時(shí)吸光度最好，故本文選用1.80 mL還原劑進(jìn)行測(cè)定，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還原劑必須現(xiàn)配現(xiàn)用，避免配置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而引起還原失效和溶液渾濁。

表4 還原劑用量對(duì)吸光度的影響

圖4 還原劑用量與吸光度的關(guān)

2.4 顯色劑用量的確定

取六只25 mL比色管，用移液管移取磷標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL，分別加入鉬酸銨1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL，搖勻，靜置幾秒后，分別加入1.80 mL亞硫酸鈉和1.80 mL對(duì)苯二酚，搖勻，加水至刻度，靜置24 min后，空白液參比調(diào)零，在波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度，數(shù)據(jù)見(jiàn)表5，據(jù)表5數(shù)據(jù)以鉬酸銨為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，見(jiàn)圖5。

表5 顯色劑用量對(duì)吸光度的影響

圖5 顯色劑用量與吸光度的關(guān)系

由圖5可知，當(dāng)顯色劑用量為1.50 mL時(shí)，吸光度最大，顯色劑加入過(guò)多或過(guò)少都會(huì)使吸光度降低，因此本文確定顯色劑用量為1.50 mL。

2.5 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取磷標(biāo)準(zhǔn)使用液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，分別置于25 mL的比色管中，依次加入1.5 mL的鉬酸銨，搖勻，靜置幾秒后，分別加入1.8 mL亞硫酸鈉和1.8 mL對(duì)苯二酚搖勻，加水至刻度，靜置24 min后，空白液參比調(diào)零，在波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度，數(shù)據(jù)見(jiàn)表6，以磷標(biāo)準(zhǔn)使用液的體積為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖6。其線性回歸方程為：y=0.0506x-0.0069，R2=0.9989，線性關(guān)系良好。

表6 體積與吸光度的關(guān)系

圖6 磷標(biāo)準(zhǔn)曲

2.6 樣品的測(cè)定

準(zhǔn)確移取試樣測(cè)試液2.00 mL及同量的空白溶液分別置于25 mL比色管中，依次加入1.50 mL鉬酸銨搖勻，靜置幾秒，加入1.80 mL亞硫酸鈉、1.80 mL對(duì)苯二酚加水至刻度搖勻，水浴靜置24 min，后，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品的吸光度并計(jì)算磷含量。測(cè)定時(shí)應(yīng)注意盡量按濃度從低到高的順序測(cè)定，減少因磷鉬藍(lán)在比色皿上的吸附而產(chǎn)生的誤差。數(shù)據(jù)見(jiàn)表7。

表7 試樣中磷含量

測(cè)定結(jié)果表明，菠菜中磷的平均含量為597.325 mg·kg-1。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了分光光度法是測(cè)定蔬菜中磷等微量元素的有效方法，同時(shí)該方法可作為蔬菜質(zhì)量檢驗(yàn)的參考方法。

2.7 加標(biāo)回收率

在樣品中分別添加不同含量的磷標(biāo)準(zhǔn)液，按本實(shí)驗(yàn)方法法每組平行測(cè)定3次，數(shù)據(jù)見(jiàn)表8，通過(guò)計(jì)算可知，回收率在98%～100%之間，說(shuō)明方法準(zhǔn)可靠。

表8 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3 結(jié)語(yǔ)

本文采用鉬藍(lán)分光光度法，通過(guò)對(duì)波長(zhǎng)、顯色時(shí)間、顯色劑和還原劑等條件的優(yōu)化，在波長(zhǎng)700 nm處加入鉬酸銨1.50 mL、還原劑1.80 mL測(cè)定了菠菜中磷的含量，結(jié)果顯示菠菜中磷的平均含量為597.325 mg·kg-1。該方法具有操作簡(jiǎn)單、試劑用量少、消解速度快、靈敏度高、選擇性好、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是一般實(shí)驗(yàn)室測(cè)定微量元素的一種行之有效的方法。該方法對(duì)進(jìn)一步研究蔬菜食用價(jià)值有一定的參考價(jià)值，為磷含量的測(cè)定提供了一定的理論依據(jù)。