郭婷婷，齊婷娟，岳成，周玉柏，李霄

北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100124

流行病學(xué)調(diào)查顯示，艾滋病仍然是一個重大的世界性公共衛(wèi)生問題。2017 年全球共有1800萬新發(fā)人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染病例，94 萬人死于與艾滋病相關(guān)的疾病[1]。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（highly active antiretroviral therapy，HAART）又稱為“雞尾酒療法”，是目前臨床治療艾滋病的首選療法。雖然HAART 可顯著降低HIV 滴度，延長患者生存時間，但同時也存在藥物毒副作用大、費(fèi)用昂貴，以及并不能有效清除體內(nèi)HIV 等問題。因此，尋找更為高效且低毒性的新型抗艾滋藥物是目前HIV 研究的熱點(diǎn)[2]。

樺褐孔菌［Inonotus obliquus（Fr.）Pilat］是擔(dān)子菌門、多孔菌科、纖孔菌屬的真菌，主要分布于俄羅斯的西伯利亞、遠(yuǎn)東地區(qū)，日本的北海道地區(qū)，以及我國黑龍江省和吉林省長白山地區(qū)[3]。已有多項(xiàng)研究報道樺褐孔菌具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗菌、降低弓形蟲感染等藥理作用，細(xì)胞毒性低，幾乎無副作用[4-6]。其生物活性成分主要有多糖、羊毛甾醇型三萜類、樺褐孔菌醇和樺褐孔菌素、黑色素類、木質(zhì)素類等[7-12]。有研究表明樺褐孔菌中含有的多糖類、三萜類等生物活性物質(zhì)可以提高機(jī)體免疫功能，抑制HIV 蛋白酶，它還具有穩(wěn)固細(xì)胞壁、阻礙病毒釋放酶、阻止病毒在細(xì)胞壁上附著、抑制病毒的繁殖和復(fù)制等多種功能。黃紀(jì)國等[13]對樺褐孔菌抗病毒活性成分進(jìn)行了分離、結(jié)構(gòu)鑒定及抗病毒活性研究，為全面了解樺褐孔菌抑制皰疹病毒機(jī)理提供了科學(xué)依據(jù)。Ichimura 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌水提取物中含有一種高分子木質(zhì)素類衍生物，具有抑制HIV-1 蛋白酶的活性。然而，樺褐孔菌水提物抗HIV 的作用以及潛在的作用靶點(diǎn)目前研究得并不充分。

我們提取了樺褐孔菌粉末水提物，在此基礎(chǔ)上對樺褐孔菌水提物的抗HIV-1 活性和潛在的作用靶點(diǎn)進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步開發(fā)基于樺褐孔菌的新型抗HIV 藥物奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

樺褐孔菌購自吉林省白山市；HEK-293T、TZM-bl 細(xì)胞，pVSVG-G 質(zhì)粒，HIV-1 B 亞型全基因組病毒骨架質(zhì)粒pSG3ΔEnv，包膜質(zhì)粒SVPB16，HIV-1 整合酶均由本實(shí)驗(yàn)室保存；CCK-8 試劑購自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；質(zhì)粒小提中量試劑盒購自天根生化科技有限公司；DNA 轉(zhuǎn)染試劑Fugene HD、螢光素酶檢測試劑盒購自Promega公司；反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（colorimetric）購自Roche 公司；DMEM 培養(yǎng)基、PBS 購自Gibco 公司；中草藥粉碎機(jī)購自天津市泰斯特儀器有限公司；Rotavapor R-200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自Buchi 公司；全波長酶標(biāo)儀購自Perkin Elmer 公司。

1.2 樺褐孔菌水提物的制備與純化

稱量樺褐孔菌粉末100 g，加入1000 mL 95%乙醇，回流提取2 次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓至乙醇完全蒸發(fā)，藥渣置于室溫干燥，按料液比1∶15（g/mL）加去離子水煮沸（2 h/次，3 次），加乙醇，靜置，抽濾，獲得粗樺褐孔菌水提物。

稱取5 g 粗樺褐孔菌水提物，加去離子水定容至50 mL，再加200 mL 無水乙醇，靜置24 h，4000 r/min 離心10 min，取沉淀，依次用95%乙醇、無水乙醇、丙酮溶液洗滌3 次，6000 r/min 離心10 min，棄上清液，沉淀置于室溫干燥后獲得純化的樺褐孔菌水提物。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和假病毒制備

HEK-293T、TZM-bl 細(xì)胞用含10%胎牛血清（FBS）、100 μg/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。制備病毒時，將293T 細(xì)胞在6 孔板中培養(yǎng)24 h，按質(zhì)量比2∶1 加入骨架質(zhì)粒pSG3ΔEnv和包膜質(zhì)粒SVPB16，按1∶3 的轉(zhuǎn)染比例與轉(zhuǎn)染試劑混合后共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，8 h 后更換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h 后離心收集上清，即HIV-1 假病毒，測定半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）。

1.4 細(xì)胞毒性檢測

采用CCK-8 法。將TZM-bl 細(xì)胞按7000/孔接種于96 孔板，樺褐孔菌水提物以12.5、25、50、100、200 μg/mL 的濃度設(shè)5 個梯度，每個梯度設(shè)3個復(fù)孔，每孔加入100 μL 不同濃度的樺褐孔菌水提物，對照組加入100 μL 完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h 后，每孔加入100 μL 用不含F(xiàn)BS 的DMEM培養(yǎng)基稀釋的CCK-8 溶液，37℃孵育1 h，用酶標(biāo)儀測D450nm值。根據(jù)下式計算水提物對TZM-bl 細(xì)胞的抑制率：

1.5 假病毒單輪感染活性試驗(yàn)

采用螢光素酶法檢測。TZM-bl 細(xì)胞按6000/孔接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h 后用含DEAE 的完全培養(yǎng)基稀釋的病毒溶液感染細(xì)胞，每孔200 TCID50，感染的同時將濃度梯度稀釋的樺褐孔菌水提物分別加到96 孔板中，每個梯度設(shè)3 個復(fù)孔，37℃孵育2 h，同時設(shè)置病毒對照組和細(xì)胞對照組（病毒對照組加入等體積的完全培養(yǎng)基和用含DEAE-纖維素的完全培養(yǎng)基稀釋的病毒溶液，每孔200 TCID50；細(xì)胞對照組加入等體積的完全培養(yǎng)基和含DEAE-纖維素的完全培養(yǎng)基），培養(yǎng)48 h，棄去部分上清，每孔加入35 μL 裂解液，室溫孵育15 min，用Promega 螢光素酶底物試劑盒處理樣品，酶標(biāo)儀測D450nm值。

用GraphPad Prism 6.0 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合處理，得到量效曲線和半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.6 VSV-G 包膜替換Env 包膜假病毒活性實(shí)驗(yàn)

通過檢測樺褐孔菌水提物對水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）替換Env 包膜的HIV-1 與TZM-bl 靶細(xì)胞融合的影響來驗(yàn)證樺褐孔菌水提物對不同包膜的HIV-1 的抑制作用，具體方法同1.5，僅將1.5 方法中的Env 包膜的假病毒替換為VSV-G 包膜的假病毒。

1.7 體外逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶活性檢測

用Reverse Transcriptase Assay 試劑盒體外檢測樺褐孔菌水提物對HIV-1 逆轉(zhuǎn)錄酶活性的抑制作用。各孔加入稀釋的樺褐孔菌水提物、HIV-1 RT 酶及反應(yīng)混合液各20 μL，混勻后37℃孵育1 h。設(shè)立不加水提物只加RT 酶的陰性對照組和陽性對照組，陽性藥選擇奈韋拉平（NVP），試驗(yàn)濃度為10 μg/mL；孵育1 h 后轉(zhuǎn)移至包被DNA（dUTP）的微孔板中，孵育1 h 后加入偶聯(lián)抗-地高辛-過氧化物酶（Anti-DIG-POD）200 μL，繼續(xù)孵育1 h，采用POD 底物（ABTS）顯色，酶標(biāo)儀測D405nm值，計算抑制率。

采用分子信標(biāo)法[15]體外檢測整合酶的活性。整合酶寡核苷酸底物序列及修飾標(biāo)記為（FAM）-5′ACTGCTAGAGATTTTCCACGTGGAAAATCTCTAG CAGT-3′（DABCYL）。各孔加入20 μL 稀釋的樺褐孔菌水提物、50 μL 反應(yīng)緩沖液、2 μL DTT、2.5 μg 重組整合酶，雙蒸水補(bǔ)足體積至100 μL。黃岑素作為陽性對照組，同時設(shè)只加整合酶不加藥物的陰性對照組。混勻后37℃孵育30 min，分別加入2 μL Mn2+、4 μL 20 pmol/L 的DNA 底物，37℃避光孵育2 h，用酶標(biāo)儀連續(xù)檢測不同時間段每孔的相對熒光單位（RFU）。

1.8 時間遞加分析實(shí)驗(yàn)

采用分時間點(diǎn)加藥實(shí)驗(yàn)來確定病毒作用的潛在靶點(diǎn)。TZM-bl 細(xì)胞按6000/孔接種于96 孔板，37℃培養(yǎng)過夜，在病毒感染細(xì)胞后的0.15、0.3、1、2、6、9、24 h 分別加入濃度大于半最大效應(yīng)濃度（EC50）10 倍以上的水提物。陽性對照組同時設(shè)4 組，分別加入1.0 μmol/L CCR5 受體拮抗劑馬拉韋羅（maraviroc，MVC）、1.0 μmol/L 逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑齊多夫定（3'-azido-3'-deoxythymidine，AZT）、1.0 μmol/L 整合酶抑制劑拉替拉韋（raltegravir，RAL）、1.0 μmol/L 融合抑制劑恩夫韋肽（enfuvirtide，T-20），同時設(shè)加入同等體積DMEM完全培養(yǎng)基的細(xì)胞對照組和只加病毒溶液的病毒對照組，每組設(shè)3 個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h 后采用螢光素酶法檢測對病毒復(fù)制的抑制作用。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與做圖，每個試驗(yàn)數(shù)據(jù)至少為3 次試驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（x±s），2 組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間用單因素方差分析，P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性檢測

為確定樺褐孔菌水提物的細(xì)胞毒性及試驗(yàn)濃度，采用CCK-8 法檢測不同濃度的樺褐孔菌水提物的細(xì)胞毒性。水提物對TZM-bl 細(xì)胞增殖的抑制作用具有明顯的量效關(guān)系，半數(shù)毒性濃度（TC50）大于200 μg/mL，說明具有良好的安全劑量范圍。以細(xì)胞抑制率≤10%時的劑量作為最大無毒劑量，最終選擇25 μg/mL 作為試驗(yàn)的起始濃度（圖1，P＜0.05）。

2.2 假病毒單輪感染活性試驗(yàn)

樺褐孔菌水提物對3 株不同包膜的HIV-1 均有抑制作用，病毒抑制率與水提物的濃度呈正相關(guān)。水提物對由骨架質(zhì)粒pSG3ΔEnv和3 種不同Env包膜質(zhì)粒制備的HIV-1 的IC50分別為12.17±2.085、5.661±1.058、8.846±1.334 μg/mL。結(jié)果表明水提物對HIV-1 均具有劑量依賴性的抑制作用（圖1，P＜0.05）。

2.3 樺褐孔菌水提物抗VSV-G 包膜替換Env 包膜假病毒活性實(shí)驗(yàn)

樺褐孔菌水提物對不同包膜的HIV-1 有抑制作用，與陽性對照AZT 相比，樺褐孔菌水提物濃度為2.7～25 μg/mL 時，隨著濃度的增大，對病毒的抑制作用越強(qiáng)，且樺褐孔菌水提物對Env 包膜的HIV-1 的抑制作用優(yōu)于VSV-G 包膜的HIV-1（圖2，P＜0.05）。

2.4 體外逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測

0.65 、12.5、25 μg/mL 的樺褐孔菌水提物對HIV-1 逆轉(zhuǎn)錄酶活性均有抑制作用，抑制率分別為13.31%±3.39%、26.24%±5.6%、28.36%±4.3%。相比對照組，25 μg/mL 的樺褐孔菌水提物具有較顯著的體外抗逆轉(zhuǎn)錄酶活性，提示樺褐孔菌水提物體可通過降低逆轉(zhuǎn)錄酶的活性而抑制HIV-1的復(fù)制（圖3，***P＜0.001）。

2.5 體外整合酶活性檢測

與對照組相比，樺褐孔菌水提物濃度為0.65和12.5 μg/mL 時的RFU 值與陰性對照組無顯著性差異（P＞0.05），樺褐孔菌水提物濃度為25 μg/mL 時的RFU 與陰性對照組有顯著性差異（P＜0.05），表明25 μg/mL 的樺褐孔菌水提物能有效抑制整合酶的活性（圖4，***P＜0.001）。

2.6 時間遞加分析實(shí)驗(yàn)

病毒感染后的前2 h 是病毒吸附和融合階段，時間遞加分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，樺褐孔菌水提物在加入早期具有較好的抑制HIV-1 效果，水提物與MVC 相比，二者具有相似的抑制曲線，說明樺褐孔菌水提物對病毒的吸附和融合階段具有抑制作用（圖5，P＜0.05）；病毒感染后2～4 h 是病毒逆轉(zhuǎn)錄過程，與陽性藥物AZT 相比，水提物對病毒的抑制率明顯降低。

3 討論

圖1 樺褐孔菌水提物對TZM-bl 細(xì)胞的毒性及體外抗HIV-1 活性（x±s，n=5）

本研究首先在分離提取樺褐孔菌水提物的基礎(chǔ)上探討樺褐孔菌水提物體外抗HIV-1 作用及潛在作用靶點(diǎn)。用CCK-8 法對樺褐孔菌水提物進(jìn)行體外細(xì)胞毒性檢測，并通過假病毒單輪感染活性實(shí)驗(yàn)評價水提物體外抗病毒活性，結(jié)果顯示樺褐孔菌水提物對HIV-1 均具有劑量依賴性的抑制作用，具有良好的體外抗HIV-1 活性。

圖2 樺褐孔菌水提物對VSV-G包膜替換Env包膜的HIV-1的抑制作用（x±s，n=5）

圖3 樺褐孔菌水提物體外對逆轉(zhuǎn)錄酶活性的抑制作用（x±s，n=3）

圖4 樺褐孔菌水提物體外對整合酶活性的抑制作用（x±s，n=3）

圖5 時間遞加分析實(shí)驗(yàn)（x±s，n=3）

為進(jìn)一步研究樺褐孔菌水提物體外抗HIV-1的潛在靶點(diǎn)，我們開展了體外逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶活性檢測，包膜替換的假病毒活性實(shí)驗(yàn)，以及時間點(diǎn)加藥實(shí)驗(yàn)。據(jù)報道樺褐孔菌中的一種高分子木質(zhì)素衍生物能夠有效抑制蛋白酶活性[14]，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)樺褐孔菌水提物對HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶活性均有抑制作用。然而，時間點(diǎn)加藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，樺褐孔菌水提物在HIV-1 的融合/進(jìn)入階段呈現(xiàn)最高的病毒抑制活性，提示樺褐孔菌水提物最佳的抗HIV-1 靶點(diǎn)可能位于HIV 感染的早期階段。

綜上所述，本研究表明樺褐孔菌水提物具有體外抗HIV-1 活性，其潛在的作用靶點(diǎn)可能位于病毒的融合、逆轉(zhuǎn)錄、整合等階段，而病毒的融合/進(jìn)入階段可能存在最佳的作用靶點(diǎn)。上述結(jié)果為基于樺褐孔菌水提物的新型抗艾滋病中藥的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。