宋詠剛，胡文慧，余鵬，石玉玲，趙雪，胡祖權(quán)，王赟，曾柱, 3***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省免疫細(xì)胞與抗體工程研究中心 生物與醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

巨噬細(xì)胞(macrophages,Mφ)是一類(lèi)具有強(qiáng)大抗原吞噬和呈遞能力的免疫細(xì)胞，具有吞噬作用和殺死入侵的病原體、釋放炎癥和愈合的介質(zhì)、抗原呈遞和加工等功能[1]。體內(nèi)的巨噬細(xì)胞通常由單核細(xì)胞(monocytes,Mo)分化發(fā)育而來(lái)[2]，Mφ和Mo共同構(gòu)成單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，在先天性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中扮演著重要角色。相比于Mo，Mφ具有更強(qiáng)的吞噬功能和呈遞抗原的能力，其中的原因值得關(guān)注。Vogel等人[3]的研究表明，Mo向Mφ的分化過(guò)程中，Mφ可能通過(guò)細(xì)胞骨架重組和黏附相關(guān)分子的表達(dá)調(diào)節(jié)其免疫學(xué)功能。因此，本研究從生物信息學(xué)角度出發(fā)，對(duì)Mφ和Mo的細(xì)胞骨架相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，為進(jìn)一步理解Mφ的免疫調(diào)節(jié)功能提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 資料

登錄美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(national centerfor biotechnology information,NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，geo dataset)，檢索array芯片數(shù)據(jù)GSE11430并下載，該數(shù)據(jù)包含5例Mo和5例Mφ的樣本資料。

1.2 方法

1.2.1分析芯片數(shù)據(jù)差異基因 使用R studio軟件affy Package對(duì)原始數(shù)據(jù)文件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并檢驗(yàn)歸一化處理的結(jié)果。使用limma Package篩選表達(dá)有顯著差異的基因(differentially expressed genes,DEGenes)，以Log|FC|≥2并且P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.2.2構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 登錄STRING在線工具(https://string-db.org/)對(duì)篩選出的DEGenes構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network, PPI)[5]，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscap軟件，使用“MCODE”插件對(duì)該相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行K核解析(k-core decomposition)，篩選出DEGenes的核心模塊[6]。

1.2.3GO和KEGG富集分析DEGenes的核心模塊 對(duì)篩選出的DEGenes的核心模塊進(jìn)行基因本體論(GO)富集和京都基因和基因組百科全書(shū)(KEGG)途徑分析，統(tǒng)計(jì)和數(shù)據(jù)可視化由RStudio中的ClusterProfiler Package執(zhí)行，篩選條件為P<0.05 并且基因數(shù)目>2[7]。

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)RStudio軟件獲得DEGenes

芯片數(shù)據(jù)(GSE11430)經(jīng)分析獲得Mφ相對(duì)于Mo的差異表達(dá)基因共476個(gè)(Log|FC|≥2,P<0.05)，其中上調(diào)基因300個(gè)，下調(diào)基因176個(gè)，由于篇幅有限，本論文按log FC大小選取上調(diào)與下調(diào)差異前5的基因，部分基因名及對(duì)應(yīng)信息見(jiàn)表1。

表1 Mφ與Mo的部分差異表達(dá)基因Tab.1 The partial differential expression of Mφ to Mo

2.2 構(gòu)建PPI

使用蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)在線分析工具STRING繪制DEGenes的PPI。結(jié)果用CYTOSCAPE軟件進(jìn)行分析，使用“MCODE”插件對(duì)該相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行K 核解析(k-core decomposition)，以軟件自帶默認(rèn)算法，篩選出12組子網(wǎng)絡(luò)，由于篇幅有限，本論文展示其中最穩(wěn)定的子網(wǎng)絡(luò)作為核心模塊進(jìn)行分析，核心模塊包含30個(gè)節(jié)點(diǎn)基因和 215條相互作用關(guān)系對(duì)(圖 1)，其中CEP55、MCM6和CCR2等基因與細(xì)胞骨架及其調(diào)控相關(guān)。

注：A為差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)，B為核心模塊。圖1 差異表達(dá)蛋白的核心模塊相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Core module interaction network of differential expression protein

2.3 GO和KEGG富集分析DEGenes

使用RStudio軟件clusterProfiler Package對(duì)篩選出的476個(gè)DEGenes進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析。GO富集分析顯示有464個(gè)富集結(jié)果，將部分結(jié)果進(jìn)行可視化處理(圖2)，其中粒細(xì)胞遷移(GO 編號(hào) 0050900, leukocyte migration)和中性粒細(xì)胞活化參與免疫反應(yīng)(GO 編號(hào)0002283, neutrophil activation involved in immune response)2個(gè)GO富集涉及細(xì)胞骨架的調(diào)控；KEGG富集分析有14個(gè)通路被富集(圖3)，使用RStudio軟件pathview Package 對(duì)分析出的KEGG結(jié)果進(jìn)行可視化，提示NOD樣受體信號(hào)通路(編號(hào)hsa04621, NOD-like receptor signaling pathway)和吞噬體信號(hào)通路(編號(hào)hsa04145, Phagosome signaling pathway)與細(xì)胞骨架的調(diào)控密切相關(guān)(圖4-5)。

圖2 差異表達(dá)基因的GO分析Fig.2 GO analysis of differentially expressed genes

圖3 差異表達(dá)基因的KEGG分析Fig.3 KEGG analysis of DEGenes

圖5 KEGG分析中的吞噬體通路Fig.5 The phagocytic pathway in the KEGG analysis

3 討論

近年來(lái)，隨著生物芯片、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)數(shù)據(jù)的分析，能挖掘出生物過(guò)程中起主導(dǎo)作用的相關(guān)分子。Mφ在體內(nèi)可以經(jīng)Mo分化而來(lái)，共同組成單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，不同于Mo，Mφ主要能遷移到炎癥或腫瘤發(fā)生部位，經(jīng)吞噬、呈遞抗原后激活T細(xì)胞[8-10]。細(xì)胞骨架主要由微絲、微管及中間纖維構(gòu)成，是Mφ變形和遷移能力的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。有研究表明，在從Mo分化為Mφ的過(guò)程中，Mφ的吞噬和運(yùn)動(dòng)能力較前者發(fā)生了較大的改變，從而導(dǎo)致Mφ獨(dú)特的免疫學(xué)功能的產(chǎn)生[11]。因此，本研究從生物信息學(xué)角度出發(fā)，分析在Mo分化為Mφ過(guò)程中細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)的差異基因的表達(dá)。本研究對(duì)差異基因核心模塊結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，有多個(gè)核心差異基因參與細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)過(guò)程，其中CEP55可以與PLK1聯(lián)合作用調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組，從而影響細(xì)胞在G1期對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附作用[12]。MCM6在細(xì)胞骨架的重組，DNA穩(wěn)定和甲基化模式中起重要作用[13]。CCR2和MCP1的共同作用下，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白重組和應(yīng)力纖維的產(chǎn)生，使細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)[14]。

GO注釋是把DEGenes的變化歸納到代謝、細(xì)胞通訊、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞周期、發(fā)育和免疫應(yīng)答相關(guān)等的生物過(guò)程中分析方法[15]，本研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)GO功能富集涉及細(xì)胞骨架及其調(diào)控因子，在粒細(xì)胞遷移中，CCL18通過(guò)PITPNM3的表達(dá)和NF-κB信號(hào)通路的激活參與細(xì)胞骨架的調(diào)控，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力[16]。CXCL8通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)受體(g protein-coupled receptors,GPCRs)家族的CXCR1和CXCR2相互作用激活Rho激酶通路、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放和整合素的表達(dá)影響肌動(dòng)蛋白骨架的重組，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的遷移和活化[17]。在中性粒細(xì)胞活化參與免疫反應(yīng)中，C3可以和Rho A相互作用，Rho A可通與活性GTP和非活性GDP結(jié)合狀態(tài)之間的分子轉(zhuǎn)換來(lái)調(diào)節(jié)下游效應(yīng)子，當(dāng)被鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors,GEF)家族激活時(shí)，RhoA蛋白隨后促進(jìn)細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白纖維的組裝導(dǎo)致細(xì)胞的遷移[18]。CD59與GM1脂筏的聚集有關(guān)，GM1脂筏的聚集可以控制許多T細(xì)胞活化和調(diào)節(jié)β1整合素功能，導(dǎo)致和基底的細(xì)胞粘附增強(qiáng)，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白的定位增加改變了細(xì)胞剛性、抗剪切能力和細(xì)胞形態(tài)[19]。

KEGG分析結(jié)果顯示，NOD樣受體信號(hào)通路和吞噬體信號(hào)通路與細(xì)胞骨架的調(diào)控密切相關(guān)。其中，NOD樣受體信號(hào)通路中的NOD2是先天免疫系統(tǒng)的模式識(shí)別受體，NOD2能與通過(guò)腳手架激酶受體相互作用蛋白(receptor interacting protein,RIP2)來(lái)激活NF-κB和MAPK途徑[20]，MAPK 和 p38調(diào)節(jié)微管蛋白表達(dá)，使胞骨架重排導(dǎo)致Mφ的遷移[21]。吞噬體信號(hào)通路(編號(hào)hsa04145,Phagosome signaling pathway)對(duì)Mφ的免疫功能有重要調(diào)節(jié)作用，其中Coronin1 蛋白處于肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)的中心，其協(xié)調(diào)Rac1激活影響肌動(dòng)蛋白活性，產(chǎn)生片狀偽足使細(xì)胞遷移及吞噬抗原功能的產(chǎn)生[22]。因此，我們推測(cè)，分化過(guò)程中細(xì)胞骨架的重組對(duì)于 Mφ免疫功能的正常執(zhí)行至關(guān)重要。

綜上所述，Mo向Mφ分化過(guò)程中細(xì)胞骨架調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生了顯著改變，這可能與Mφ的免疫功能直接相關(guān)，為進(jìn)一步理解Mφ的免疫調(diào)節(jié)功能奠定了理論基礎(chǔ)。