金鑫 張志亮 陸毅 黃一雄 范志宏 陳蕊

各種原因造成的大面積骨缺損及難治性骨損傷的修復(fù)是臨床的一大難題。目前常見(jiàn)的治療方法都有各自的局限性，而再生醫(yī)學(xué)和組織工程技術(shù)的發(fā)展為修復(fù)骨缺損提供了新的思路。

組織工程常用的成體干細(xì)胞有BMSCs 和ADSCs。BMSCs 成骨能力良好，是骨組織工程最佳的種子細(xì)胞來(lái)源。但因其取材困難、過(guò)程痛苦、細(xì)胞含量少等原因限制了其更廣泛的應(yīng)用。ADSCs 來(lái)源廣泛、細(xì)胞量多、易獲取、培養(yǎng)簡(jiǎn)單且擴(kuò)增能力強(qiáng)等[1]，成為骨組織工程種子細(xì)胞的研究熱點(diǎn)。但相比于BMSCs，其成骨能力不足[2]。因此，利用ADSCs 的既有優(yōu)勢(shì)，提高其成骨能力是亟待研究和解決的問(wèn)題。

本研究將SD 大鼠的ADSCs 及BMSCs 以Transwell 共培養(yǎng)，觀察BMSCs 對(duì)ADSCs 成骨分化的影響，探討提高ADSCs 成骨活性的可能途徑。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)中ADSCs 及BMSCs 取自6 周齡雄性SD大鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司）。

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、Penicillin-Streptomycin、Osteocyte Differentiation Basal Medium（Gibco，美國(guó)），L-抗壞血酸-2-磷酸酯鎂鹽AA2P、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、茜素紅、膠原酶（Sigma，美國(guó)），氯化十六烷基吡啶（上海德茂化工有限公司）。

光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡（奧林巴斯，日本），Infinite M2000 PRO 酶標(biāo)儀（Tecan，瑞士），細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermaoFisher Scientific，美國(guó)）。

1.2 ADSCs 及BMSCs 的分離及培養(yǎng)

6 周齡雄性SD 大鼠頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下75%乙醇浸泡1 min 后取出附睪脂肪墊，將脂肪組織盡量剪碎，放入含有等體積、預(yù)熱PBS 緩沖液的15 mL 離心管中，震蕩45 sec，靜置分層，吸除下層液體。重復(fù)上述兩步驟，直至下層變澄清。加入膠原酶溶液，37 ℃水浴震蕩，直至組織懸液混勻（50 min）。渦旋15 sec，徹底混勻細(xì)胞，離心（1 200 r/min，5 min）后小心吸除上清液，加入完全培養(yǎng)基后置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。24 h 后換液，去除未貼壁ADSCs細(xì)胞，以后每3 天換液一次。

取大鼠股骨和脛骨置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿上方，依次用3～5 mL PBS 和無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗2～3 次后移入另一無(wú)菌培養(yǎng)皿中。顯露骨髓腔后用1 mL 注射器吸取培養(yǎng)基，從股骨一端插入，從上至下緩慢沖洗骨髓腔，用下方的無(wú)菌培養(yǎng)皿收集骨髓懸液，重復(fù)此過(guò)程2～3 次。在15 mL 離心管中加入3 mL 培養(yǎng)基，再用吸管沿管壁緩緩加入骨髓懸液，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入完全培養(yǎng)基，并輕輕吹散細(xì)胞10～20 次制成細(xì)胞懸液，接種到10 mm 培養(yǎng)皿中，放入CO2培養(yǎng)箱中。3 d 后換液，去除未貼壁BMSCs 細(xì)胞。以后每3 天換液一次。

7～10 d 后，待兩種細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，0.25%胰酶消化傳代，按1×104cells/cm2密度接種于新的培養(yǎng)瓶中。本實(shí)驗(yàn)使用第2 代BMSCs 及ADSCs（經(jīng)三系分化誘導(dǎo)及流式細(xì)胞檢測(cè)證實(shí)具有相應(yīng)間充質(zhì)干細(xì)胞特性）。

1.3 ADSCs 及BMSCs 以Transwell 共培養(yǎng)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

第一組：?jiǎn)渭傾DSCs 組；第二組：共培養(yǎng)組（ADSCs:BMSCs=1:1），上室為BMSCs，下室為ADSCs；第三組：?jiǎn)渭傿MSCs 組。

取第2 代ADSCs 及BMSCs 進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。0.25%胰酶消化，離心后細(xì)胞計(jì)數(shù)。重懸兩種細(xì)胞至密度為1×105cells/mL。各組細(xì)胞按照分組比例加入Transwell 皿中，第一組1 mL 單純ADSCs 懸液；第二組1 mL ADSCs+1 mL BMSCs；第三組1 mL 單純BMSCs 懸液。各孔加入完全細(xì)胞培養(yǎng)基。24 h 后更換成骨誘導(dǎo)液。每隔3～4 天換液1 次，21 d 后進(jìn)行相關(guān)染色及檢測(cè)。

1.3.2 茜素紅染色及半定量檢測(cè)

PBS 清洗細(xì)胞表面2 遍，10%甲醛固定1 h。用新鮮配制的40 mM（pH 4.2）的茜素紅染液室溫孵育10 min，dH2O 清洗5 遍，PBS 孵育15 min，晾干，光鏡下觀察并拍照。

茜素紅染色后，PBS 洗3 遍。棄上清，加入氯化十六烷基吡啶置于室溫下30 min。吸取上清，置入96 孔板，每孔100 μL。使用酶標(biāo)儀，波長(zhǎng)562 nm 處測(cè)樣本吸光值A(chǔ)。用氯化十六烷基溶液調(diào)零，并同時(shí)測(cè)定一組未加誘導(dǎo)液的單純細(xì)胞的茜素紅染色吸光值A(chǔ)。每個(gè)樣本重復(fù)3 次，計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。其中，樣本測(cè)定值A(chǔ)=樣本吸光值A(chǔ)-單純細(xì)胞組吸光值A(chǔ)。將各組測(cè)得值以ADSCs 作為基準(zhǔn)進(jìn)行歸一化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩種細(xì)胞的分離培養(yǎng)及Transwell 共培養(yǎng)

原代ADSCs 在24 h 后貼附于培養(yǎng)皿表面，并開(kāi)始沿培養(yǎng)皿底面伸展。培養(yǎng)至第2 代后，可見(jiàn)細(xì)胞與培養(yǎng)皿接觸面積增大，由不規(guī)則狀變?yōu)榈湫偷拈L(zhǎng)梭形。原代BMSCs 克隆樣散在分布，以圓形貼壁細(xì)胞為主。傳至第2 代，細(xì)胞形態(tài)均一，螺旋狀生長(zhǎng)。將兩種第2 代細(xì)胞以Transwell 共培養(yǎng)，ADSCs 位于下層小室中，BMSCs 位于上層小室內(nèi)。

2.2 茜素紅定性及半定量染色

茜素紅染色顯示，ADSCs 與BMSCs 以Transwell共培養(yǎng)后出現(xiàn)了成骨效能的變化，茜素紅染色陽(yáng)性的鈣鹽沉積明顯增多。茜素紅半定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組結(jié)果與ADSCs 組相比，差別顯著（P＜0.05），表明BMSCs 與ADSCs 共培養(yǎng)后能夠通過(guò)旁分泌的方式產(chǎn)生相關(guān)生化信號(hào)，刺激ADSCs 的成骨分化。而共培養(yǎng)組與BMSCs 組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明混合培養(yǎng)后的成骨效能與單純BMSCs 組相當(dāng)（圖1）。

圖2 各組茜素紅染色及半定量檢測(cè)Fig.2 Alizarin Staining and relative ARS level of each group

3 討論

ADSCs 是一種具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，由于其增殖能力強(qiáng)、取材容易、在體外培養(yǎng)中易定向分化為成骨細(xì)胞等優(yōu)勢(shì)，成為骨組織工程的種子細(xì)胞之一。Lendeckel 等[3]嘗試使用自體ADSCs 來(lái)治療1 例顱骨嚴(yán)重缺損的患者。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將ADSCs 植入小鼠顱骨缺損部位，12 周后能夠完全形成骨化橋接。相較于其他來(lái)源干細(xì)胞，ADSCs 具有更強(qiáng)的增殖、成血管能力以及遷移和歸巢的能力，但其成骨能力相較于BMSCs 還顯不足[4]。以自體ADSCs 為種子細(xì)胞的顱骨修復(fù)的結(jié)果表明，由于其骨化不全等并發(fā)癥，修復(fù)效果不能令人滿意[5]。單純用ADSCs 為種子細(xì)胞修復(fù)承重骨的研究更為少見(jiàn)。因此，提高ADSCs 的成骨效能是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

目前，提高ADSCs 成骨分化能力的方法主要有外源性因子調(diào)控[6]、基因工程調(diào)控[7]和物理調(diào)控[8]。共培養(yǎng)即屬于加入外源性因子的方法。共培養(yǎng)技術(shù)能夠更好地模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境和細(xì)胞的性狀，利用一種輔助細(xì)胞去誘導(dǎo)目的細(xì)胞的分化、增殖及細(xì)胞活性的維持，進(jìn)一步探究其中的機(jī)制。與體內(nèi)研究相比，共培養(yǎng)系統(tǒng)體積小、參數(shù)可控、結(jié)果直觀，更有利于研究細(xì)胞與細(xì)胞間，以及細(xì)胞與微環(huán)境間的相互作用。

Transwell 間接共培養(yǎng)，也叫分層滲透培養(yǎng)。主要用于研究細(xì)胞間的相互調(diào)節(jié)作用。兩種細(xì)胞在同一培養(yǎng)皿中共培養(yǎng)，但由一層多孔膜相隔，使得兩種細(xì)胞間只存在彌散因子的移動(dòng)交換而沒(méi)有直接接觸。本實(shí)驗(yàn)中，ADSCs 與BMSCs 以Transwell 共培養(yǎng)，排除了BMSCs 對(duì)ADSCs 細(xì)胞直接接觸的影響。茜素紅及半定量染色結(jié)果表明，ADSCs 與BMSCs 共培養(yǎng)后，鈣鹽沉積量顯著提高，成骨礦化能力增強(qiáng)。表明BMSCs 可通過(guò)旁分泌相關(guān)細(xì)胞因子來(lái)提高ADSCs 的成骨分化能力，為ADSCs 成骨分化提供良好的微環(huán)境。

間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化受到多種信號(hào)通路的調(diào)控。目前主要研究的MSCs 成骨相關(guān)信號(hào)通路包括TGF-β 信號(hào)通路、MAPK 通路、JNK 通路、PI-3K通路、Notch 通路、Wnt 信號(hào)通路等。間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化有許多信號(hào)通路參與，或許還存在沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的信號(hào)通路，大多數(shù)信號(hào)通路的確切機(jī)制并不明了，有關(guān)各通路之間相互聯(lián)系的研究較少。因此，進(jìn)一步研究信號(hào)通路任重道遠(yuǎn)。在Transwell 共培養(yǎng)體系中，BMSCs 旁分泌作用的細(xì)節(jié)仍未闡明，尚待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。